复现 Shalek et al. 树突状细胞 LPS 响应数据：从 GSE48968 到炎症/IFN 程序和细胞间异质性

科学更正（2026-07-19）： 早期页面曾未充分区分细胞与生物学重复。公开矩阵 metadata 不能为每个时间点和 KO 条件识别条件内生物学重复，因此总体效应显著性、稳定效应或可推广机制推断均已撤回。本文现将时间曲线、KO 与 IFNB 图限定为该公开实验中的细胞级描述分布；replicate_structure_audit.tsv 逐组记录了这一边界。

Shalek et al. 这组树突状细胞刺激数据的重点不止于再画一张 LPS UMAP，而在于它把一个常见项目痛点放得很清楚：同样暴露在 LPS 下，单个细胞不等于整齐地一起“响应”；沿着早期炎症/NFkB、晚期 IFN/ISG、抗原呈递背景和细胞间变异几个方向分开。复现这类数据时，有用的是把响应程序拆开，并说明哪些信号可以从公开 TPM 矩阵复现，哪些原文机制需要额外实验或 raw-level 分析支撑。

为什么选这篇文献？

免疫刺激单细胞项目很容易被写成一句话：刺激组和对照组分开了，marker 上升了，说明有响应。但真实项目里最麻烦的通常不等于“有没有响应”；以下几个问题：

刺激后所有细胞都在同一条路径上变化吗？早期炎症因子和晚期 interferon-stimulated genes 是同一个响应轴，还是两个时间和调控逻辑不同的程序？4 小时和 6 小时看到的 IFN 信号，是所有细胞一起增强，还是一部分细胞进入强响应状态？扰动组里看到的差异，能不能从表达矩阵层面讲清楚，而不把它夸大成完整机制证明？

这正是 Shalek et al. 这篇经典 Nature 文章的吸引点。原文题目是 Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation，主要研究线索是用单细胞 RNA-seq 看 primary mouse dendritic cells 在多种 pathogen components 刺激下的动态和细胞间差异。本文只聚焦其中最适合公开复现和讲清证据链的一条线：LPS 时间响应，以及与 IFN/STAT/TNF 相关扰动组在公开 allgenes TPM 矩阵中的可恢复信号。

论文和数据来源

论文、数据和公开矩阵信息如下。这里先把来源和矩阵层级交代清楚。

公开矩阵进入分析前，先确认数据层级和规模。

复现边界： 本文使用 GEO 中公开的 allgenesTPM 矩阵。它适合做 processed-matrix 层面的表达结构、模块评分、marker heatmap 和扰动组趋势复现，但不等于 FASTQ-level 重新比对，也不等于 raw UMI count 质控。原文关于 paracrine control 的实验设计和机制解释可以作为对照背景，但本文不会仅凭 TPM 矩阵把表达程序写成因果机制。

方法和分析流程

本文的处理顺序从数据层级开始：从 GEO 下载两份 allgenes TPM 文件和两个 platform-specific series matrix，核对标题、GSM、刺激条件和技术重复信息；从主矩阵中筛选 Unstimulated、LPS 1h/2h/4h/6h、Unstimulated replicate、LPS 4h replicate、IFNB 2h、Ifnar1/Stat1/Tnfr KO LPS 4h 等与本文主线相关的细胞；对 TPM 做 log1p 转换，过滤低检出基因，选取高变基因，进行 PCA、UMAP 和 KMeans response-state 划分；构建炎症/NFkB、IFN/ISG、Antigen/DC 和 cell-cycle 模块评分，并检查每个模块的基因命中情况；把 UMAP、状态组成、模块评分、marker heatmap、扰动组对照和 QC 可读性图串成一条证据链，而不等于连续堆图。这组处理先确认公开矩阵能支撑哪些问题，再把结果图解释限制在当前证据内。

先看数据设计：这不等于一个简单两组比较

Shalek 这组数据里，主文件包含 Unstimulated、LPS 多时间点、PAM/PIC、IFNB、Stat1/Ifnar1/Tnfr KO、on-chip stimulation 和 tube control 等多种实验设计。公开文章如果把它压成“LPS vs control”会丢掉最重要的信息：不同时间点和扰动组其实在回答不同层级的问题。

图 1. 本文选入 1,051 个与 LPS/IFN/扰动主线相关的细胞。公开标签中虽有单独的 4h replicate 组，但没有为每个时间点和 KO 条件提供可识别的条件内生物学重复，因此这里只记录设计与细胞数。

这张图先用于核对输入层级。细胞数、基因检测量、样本标签和矩阵层级如果没有对齐，后面的降维、marker 和组成分析都只能算可视化，不能作为复现结论。

这个设计也决定了后面的写法：本文不追求复刻原文所有刺激和实验，要把 LPS 这一条线讲清楚。PAM/PIC 和第二份 TPM 文件中的其他命名组可以作为数据背景，但如果全部铺开，会把文章变成浅层总览，反而削弱最有价值的响应程序分析。

LPS 时间结构：响应是动态轨迹，不等于一个标签

先看 LPS 主时间线的 UMAP。这里的 UMAP 不用于证明“时间就是空间距离”，需要检查公开 TPM 矩阵是否仍然保留从未刺激、早期刺激到晚期刺激的转录组结构。

图 2. LPS 主时间线在 UMAP 上形成明显的动态结构。Unstimulated 细胞主要位于一侧，1h 与 2h 处在早期响应区域，4h 和 6h 进入更晚的响应空间。这个图支持“刺激响应随时间重排”，但不应被写成真实发育轨迹或空间距离。

从图上可以看到，LPS 1h 没有简单落在 control 和 6h 的中点；2h、4h、6h 也没有完全离散的三块。值得写进文章的是这种非整齐的结构：同一个时间点内部仍然有相当大的细胞间差异，而不同时间点之间又有明显的整体迁移。这种现象在实际刺激实验中很常见，也是单细胞复现比 bulk 平均更有价值的地方。

响应状态组成：同一时间点内部也有分层

如果只看时间标签，容易误以为 1h、2h、4h、6h 分别对应四种状态。为了避免这种过度简化，我们在 PCA 空间上做了无监督 response-state 划分，再看每个时间点中这些状态的比例。

图 3. 左侧显示 5 个无监督 response states，右侧显示不同 LPS 时间点中的状态比例。LPS 1h 主要集中在早期状态，4h/6h 明显富集晚期状态，但每个时间点内部都存在多种状态。这说明 LPS 响应更适合按“时间 + 程序 + 细胞间差异”来读。

这个图对类似项目很有启发。很多刺激实验的痛点不等于“分几群”；某个时间点内部是否存在强响应和弱响应细胞，后续是否需要按 response state 而不只按 treatment 做差异分析。本文不把这些 state 命名成新的细胞类型，只把它们作为响应结构来使用，这是比较稳妥的写法。

炎症/NFkB 和 IFN/ISG：两个响应轴需要分开读

随后是本文最关键的一张图。我们用代表性基因构建了炎症/NFkB、IFN/ISG 和 Antigen/DC 模块评分。模块基因实际命中情况完整：炎症/NFkB 命中 TNF、IL1A、IL1B、CXCL1、CXCL2、CCL3、CCL4、PTGS2、NFKBIA、TNFAIP3、IER3、JUN、FOS；IFN/ISG 命中 IFNB1、IFIT1/2/3、ISG15、OASL1/2、MX1/2、IRF7、STAT1/2、RSAD2、USP18、CXCL10 等。

图 4. 炎症/NFkB 模块在 LPS 1h 已明显上升，2h 后仍保持较高但不呈单调增强；IFN/ISG 模块在 4h 和 6h 更强，并与时间的相关性更明显。Antigen/DC 模块更多反映细胞背景和检测差异，不应被当作刺激主轴。

这张图直接回答了一个真实项目里常见的问题：刺激组看到的“响应”到底是什么响应？如果只做 stimulated vs control，一组早期 inflammatory genes 和一组后期 IFN/ISG genes 可能被混在同一个差异基因列表里。单细胞复现的作用在于把它拆开：早期炎症轴和晚期 IFN 轴可以同时存在，但它们的时间结构、细胞间变异和解释边界不同。

把模块投回 UMAP：哪些细胞处在强响应区域？

模块评分不能只看 boxplot。把评分映射回 UMAP，可以检查高分细胞是否集中在特定响应状态，还是散在多个区域。

图 5. 炎症/NFkB 和 IFN/ISG 模块在 UMAP 上的空间分布并不完全重合。早期炎症模块更接近 LPS 1h/2h 相关区域，而 IFN/ISG 高分细胞更多集中在 4h/6h 晚期响应区域。这个图帮助区分“同一刺激引发的不同程序”。

这里需要注意的是措辞：UMAP 上的颜色梯度提示表达程序在不同细胞中强弱不同，但不能单独证明细胞之间存在真实转化路径。更准确的写法是：公开 TPM 矩阵支持不同响应程序在单细胞层面的分布差异，后续如果要做动力学模型，需要更完整的时间点、重复和模型设定。

marker heatmap：从基因层面核对模块解释

模块评分是汇总指标，必须回到具体 marker 检查。下面这张 heatmap 汇总代表性炎症、IFN 和 DC 背景基因在 LPS 时间线中的平均表达趋势。

图 6. TNF、IL1A、CXCL1/2、NFKBIA、TNFAIP3 等代表早期炎症/NFkB 相关响应；IFNB1、IFIT、ISG15、IRF7、STAT1、CXCL10 等代表 IFN/ISG 轴。heatmap 使模块解释回到具体基因，而不等于停留在抽象 score。

这类图要按成组证据来读。单个基因或局部高表达只能提供线索，只有 marker panel、signature score、metadata 和组成信息互相支持时，才适合写成细胞身份、状态或谱系倾向。

这一步是很多复现文章缺少的部分。单个 marker 容易受表达稀疏和检测不稳定影响，直接挑一个基因写结论风险很高。更稳妥的做法是用一组 marker 共同支持一个程序，同时说明它是 expression program，而不等于机制证明。

炎症轴和 IFN 轴的关系：相关，但不能混为一谈

把每个细胞的炎症/NFkB score 和 IFN/ISG score 放到同一张散点图里，可以看到两个程序之间存在一定关系，但没有完全重叠。

图 7. 炎症/NFkB 与 IFN/ISG 两个轴在单细胞层面有相关性，但不等于同一条线。部分早期细胞炎症分数较高而 IFN 分数较低，晚期细胞 IFN/ISG 分数更高。这解释了为什么刺激实验不能只用一个“activation score”概括。

在本文主时间线中，IFN/ISG score 与时间的相关性更强，而炎症/NFkB score 更像早期快速响应后进入分散状态。这不等于在复述原文结论，从公开 TPM 矩阵重新组织得到的一个可视化证据链：response 的强弱、类型和时间不等于同一个概念。

扰动组：能恢复表达差异，但不能越界写机制

主文件中还包含 IFNB 2h、Ifnar1 KO LPS 4h、Stat1 KO LPS 4h 和 Tnfr KO LPS 4h 等组。它们很适合放在文章的“深度边界”部分：这些组能帮助我们判断 IFN/STAT/TNF 相关表达程序是否可从矩阵层面恢复，但不能把矩阵复现直接等同于完整机制实验。

图 8. 各公开标签下的单细胞 module-score 分布。箱线图描述细胞分布，不提供条件层面的置信区间或显著性；KO 与 WT 的方向差异只能作为该实验中的描述性观察。

这里不能把数百个细胞当作数百个独立重复。公开矩阵可显示 IFN/STAT/TNF 相关组的细胞级分布，但没有条件内生物学重复就不能估计总体扰动效应、显著性或跨实验稳定性。更深入的比较需要回到原始实验批次、动物/培养重复和 replicate-aware 模型。

QC 可读性：TPM 矩阵也要检查

虽然本次使用的是 TPM 矩阵，不等于 raw counts，仍然需要做基本可读性检查。这里不能写线粒体比例或 UMI 深度那类不适合 TPM 矩阵的 QC 语言，但可以检查每个细胞检测到的基因数和总 TPM 分布。

图 9. TPM 矩阵中各时间点的 detected genes 和 total TPM 分布。这个图用于说明数据可读性和技术差异，而非 raw-count 级别的测序质量评估。公开复现时，QC 语言必须和矩阵层级匹配。

这张图把观察落到基因证据上。读的时候要看一组 marker 是否同向，而不是只挑某个显眼基因；如果证据只停留在 score 层面，结论也要保留探索性。

这个边界很容易被忽略。很多文章会习惯性写“过滤低 UMI、线粒体比例”等步骤，但这里的公开文件是 allgenes TPM，不能把 10x UMI 数据的语言直接套过来。严肃复现的第一步就是按矩阵层级选择正确的说法。

动态基因：从平均趋势补充单细胞图

结尾处看 top dynamic genes across LPS time-course。这个图用于补充说明哪些基因在时间平均层面贡献了动态结构。

图 10. 高动态基因 heatmap 帮助把 UMAP 和模块评分落回具体基因。它适合展示整体时间趋势，但不能单独决定每个基因的显著性或机制角色；如果要做正式差异模型，需要进一步设置重复、时间和扰动因素。

marker 和 score 要成组解释。单个基因高表达只能提供线索；只有 dotplot、heatmap、signature、metadata 和组成结果互相支持，才适合写成细胞身份或状态判断。

这类图适合放在长文后半部分，因为读者已经知道了数据设计、主结构、模块和扰动组边界。把它放在这里，可以让文章从“看见结构”进入“哪些基因支撑结构”的层面。

与源论文主线的对照

本次复现与源论文主线一致的地方主要有三点。

第一，公开 TPM 矩阵仍然保留了 LPS 刺激下的时间相关结构。Unstimulated、1h/2h、4h/6h 在低维空间和模块评分中呈现可读的转录组差异。

第二，细胞间异质性是这组数据的重要特征，并且有生物学解释空间。相同时间点内部存在不同 response states，说明刺激实验不能只按时间点平均后下结论。

第三，炎症/NFkB 和 IFN/ISG 两类程序可以在公开矩阵中分开讨论。早期炎症轴和晚期 IFN 轴在时间、UMAP 分布和扰动组趋势上都显示出不同特征。

但也有必须保留的边界。原文关于 dynamic paracrine control 的解释，不只是表达矩阵本身得来的，还依赖实验设计、扰动和原文分析框架。本文能说的是：公开 TPM 矩阵支持 LPS 响应程序的动态和异质性复现，并能在 Ifnar1/Stat1/Tnfr 等扰动组中观察到与主线一致的表达趋势。本文不能说的是：仅凭这套重分析就完整证明旁分泌机制。

深度解读：证据链和解释边界

回答范围：经典刺激响应数据在公开 TPM 层面还能否被整理成一条可信证据链。答案是可以，但必须按程序和时间拆开，而不能只写 stimulated vs control。

raw / processed matrix 边界：GSE48968 的公开补充文件给出的是 allgenes TPM 矩阵，因此本文适合做表达结构、模块评分、marker heatmap 和扰动趋势复现；不适合写 FASTQ 级比对质量、UMI 质控、完整差异模型或新的机制推断。

主要图读法：UMAP 用来确认 LPS 时间结构；state composition 用来说明同一时间点内部存在异质性；module score 和 marker heatmap 用来拆分炎症/NFkB 与 IFN/ISG；perturbation score 用来判断 IFN/STAT/TNF 相关组在矩阵层面的表达趋势。

不能过度解释的部分：不能把 UMAP 距离写成真实时间速度，不能把 response state 写成新的稳定细胞类型，不能把 IFN/ISG score 写成机制证明，不能把 KO 组 boxplot 直接写成完整因果模型。更准确的写法是：这些图提供表达层面的证据和后续分析方向。

如果继续深入，下一步应该做什么？可以在 raw reads 可得的前提下重新比对并构建更完整的表达矩阵；可以建立时间点和扰动因素共同参与的差异模型；可以把早期炎症、IFN/ISG、cell-cycle 和 antigen presentation 程序做成更系统的 signature panel；也可以围绕强/弱响应细胞做更细的状态分层。

对类似项目有什么启发？

这篇数据很像真实项目里常见的刺激实验：老师或课题组往往已经有 public 或 private scRNA-seq 数据，也有一个明确刺激条件，但结果写不深。把它写深的关键要回答几个痛点：响应是否同步；不同响应程序是否混在一起？强响应细胞占多少？marker 是单个基因还是成组支持？扰动或时间设计能支持到什么层级？

如果一个旧项目只有对照/刺激两个标签，仍然可以从 response score、marker panel、细胞状态组成和样本层面对照里挖出更清楚的解释。如果有时间点、扰动或重复，分析空间会更大，但结论也更需要边界。越是想做出有吸引力的图，越不能跳过证据审核。

• 痛点 2：module score 是表达线索，不等于机制证明。它必须结合 marker heatmap、metadata 和实验设计来解释。
• 痛点 3：processed TPM 矩阵不能套用 UMI/raw-count 质控语言。矩阵层级决定能说到哪里。
• 痛点 4：扰动组最适合做边界清楚的趋势复现，而不等于被包装成新的因果结论。

小结

本次复现从 GSE48968 公开 allgenes TPM 矩阵出发，围绕 LPS 时间响应整理了 1,051 个相关细胞、479 个主时间线细胞和 10 张结果图。公开矩阵中可描述 LPS 时间标签对应的表达结构、炎症/NFkB 与 IFN/ISG 两类程序，以及同一标签内部的细胞间异质性；IFNB、Ifnar1/Stat1/Tnfr 相关组只提供单实验细胞分布对照。

这篇文章的重点不在证明一个新机制，而在示范经典单细胞刺激数据如何被整理成可审查、可复用、可继续深入的证据链。对类似项目而言，更需要保留的是把“有响应”进一步拆成“什么程序、哪些细胞、哪个时间、什么边界、下一步怎么深入”。