复现 Nestorowa et al. HSPC 分化单细胞图谱：从 GSE81682 到谱系相关表达梯度

Nestorowa et al. 这篇 HSPC 分化单细胞数据需要重点呈现一个造血发育项目中很常见的痛点：FACS 分选得到的 LT-HSC、HSPC、progenitor 富集群体，并不等于转录组上完全离散的命运标签。复现这类数据时，最需要讲清的是 marker 是否支撑、谱系倾向是否连续、哪些细胞只是处在过渡区，以及公开 counts 矩阵能把结论支持到什么层级。

方法修订（2026-07-19）： Stem/HSC、Myeloid、Ery/Meg、Lymphoid/Flt3 和 Cell-cycle 均保留为连续 signature score。公开数据没有外部独立身份标签，也没有经过校准的绝对阈值、top-two margin 和拒绝规则，因此 1,652 个 QC 细胞全部标为 unassigned，不再按最高分生成 lineage call，也不再展示 FACS gate 内的离散谱系比例。图 6-7 的监督分数轴只用于可视化表达梯度；同一 marker 家族沿轴变化属于内部一致性，不能证明分化方向。

为什么选这篇文献？

造血发育和干祖细胞项目很容易被写成“某群是 stem，某群是 myeloid，某群是 erythroid/megakaryocytic”。这种写法看似清楚，但在单细胞数据里经常过于硬。做复现或旧项目再分析时，老师通常关心的是：FACS gate 只是富集，还是可以直接当成细胞命运？marker 是单个基因支持，还是一组基因共同支持？某些细胞看起来像 progenitor，是因为真的进入某条谱系，还是只是 cell-cycle、测序深度或表达稀疏造成的局部差异？

Nestorowa et al. 2016 年发表在 Blood 的文章 A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation，正好适合作为这个问题的公开复现案例。它不是疾病数据，也也不是大型 atlas；一组围绕小鼠骨髓 HSC/HSPC/progenitor 的经典分化图谱。对类似项目而言，吸引人的点不等于“我们也能跑 UMAP”，关键在于能否把“连续分化”和“谱系倾向”讲得比硬标签更稳。

论文和数据来源

论文、数据和公开矩阵信息如下。这里先把来源和矩阵层级交代清楚。

公开矩阵进入分析前，先确认数据层级和规模。

复现边界： 本文使用 GEO 公开的 HTSeq counts 矩阵和 series matrix 元数据。它适合做 count-matrix 层面的 QC、log-normalization、HVG/PCA/UMAP、marker/signature score、FACS gate 富集和连续性可视化；它不能替代作者原始流程中的全部 fate model，也不能仅凭这套公开矩阵证明单个细胞的最终命运。

方法和分析流程

本文的处理顺序从数据层级开始：从 GEO 下载 GSE81682_HTSeq_counts.txt.gz 和 GSE81682_series_matrix.txt.gz，核对公开矩阵细胞列、GSM、样本标题和 FACS 富集标签；用 GENCODE mouse vM25 注释把 Ensembl gene id 映射到 gene symbol，并对重复 symbol 求和；按 2.25M-30M total counts 的矩阵深度窗口保留 1,652 个细胞；完成 library-size normalization、log1p、高变基因选择、PCA、UMAP 和无监督状态划分；随后计算 5 组连续 signature。所有细胞维持 unassigned，FACS gate 只作为实验富集信息，无监督 state 只作为表达结构参照。

先看公开矩阵：1920 列不等于直接可解释的 1920 个结果

这套 GEO counts 矩阵一共有 1,920 个细胞列，列名包含 LT-HSC、HSPC 和 Prog 三类前缀。GEO 和原文常被引用的 1,656 个细胞规模，更接近作者筛选后的可用细胞数。公开复现时不应该直接把 1,920 当成最终分析规模，也不应该为了凑数字任意过滤。

图 1. 公开矩阵包含 1,920 个细胞列。本文使用 2.25M-30M total counts 的矩阵深度窗口，保留 1,652 个细胞，数量接近文献/GEO 常见的 1,656 细胞规模。上限不等于为了“丢掉不喜欢的细胞”，用于避免少数极端高深度细胞在低维可视化中造成不成比例的影响。

这个 QC 选择也说明了严肃复现的一个原则：公开矩阵里能看到的细胞数、作者文章里报告的细胞数、我们用于下游结果图的细胞数，三者不一定完全相同。还要看把过滤逻辑写清楚，让读者知道后面的 UMAP、marker 和 signature 是在什么数据层级上得到的。

FACS gate 和转录组结构：富集不等于硬边界

下图把 QC 后的细胞投影到 UMAP，并分别按 FACS 富集标签和无监督表达状态着色。直观上可以看到 LT-HSC、HSPC 和 Prog 不等于完全随机混合，但也不等于三块干净分开的岛。

图 2. UMAP 显示 Prog 细胞在一侧明显富集，LT-HSC/HSPC 在另一侧和中间区域更多，但不同 FACS 标签之间存在过渡和混合。右图的无监督状态说明表达结构可以分层，但这些 state 只能作为表达状态使用，不应直接命名成固定命运。

这正是 Nestorowa 数据的价值所在。FACS gate 是强有力的实验富集信息，但它不等于单细胞转录组的最终解释。一个 HSPC 标签下的细胞可能保留较高 stem signature，也可能已经出现 Flt3、myeloid、erythroid/megakaryocytic 或 cell-cycle 倾向。复现文章如果直接把 gate 写成细胞类型，会错过这篇数据最关键的“连续分化”信息。

lineage signature：用成组 marker 看倾向，而不等于用单基因定命运

为了避免单个 marker 的表达稀疏和检测不稳定影响解释，本文用成组基因构建了五类 signature。Stem/HSC 模块命中 Hlf、Meis1、Procr、Mllt3、Mecom、Hoxa9、Gata2、Fgd5、Ly6a；Myeloid 模块命中 Csf1r、Lyz2、Mpo、Elane、Cebpa、Irf8 等；Ery/Meg 模块命中 Gata1、Klf1、Hba-a1、Hbb-bs、Pf4、Itga2b、Mpl、Vwf 等；Lymphoid/Flt3 模块包含 Il7r、Dntt、Rag1/2、Flt3、Ebf1、Pax5、Bcl11a；Cell cycle 模块包含 Mki67、Top2a、Cdk1、Pcna、Mcm5/6 等。

图 3. 前五幅图展示连续 signature score，第六幅图只显示每个细胞的最大连续分数。最大值没有被转换成身份标签；所有细胞仍为 unassigned。Stem/HSC 高分区域与 LT-HSC/HSPC 富集区相关，Myeloid、Ery/Meg 和 Cell-cycle 信号在其他区域增强。

这一点对类似造血项目需要先确认。读者需要的是“哪些细胞值得进一步深挖”，而不等于一个看似确定的硬标签。signature 的价值是把 marker 证据做成可比较的连续指标：某个细胞或状态更像 Stem/HSC、更偏 Myeloid、出现 Ery/Meg 倾向，还是主要表现为增殖活跃。

FACS 标签内也有分化倾向差异

把 signature score 按 FACS gate 展开，可以看到 gate-level 富集关系：LT-HSC 和 HSPC 更偏 Stem/HSC，Prog 更偏 Myeloid/Ery-Meg/Cell-cycle。但每个 gate 内部都有分散。

图 4. FACS gate 和 signature 倾向方向一致，但不等于一一对应。Prog 群体总体更偏下游谱系和 cell cycle，LT-HSC/HSPC 保留更高 stem signature；同时，每个 gate 内部仍存在明显分布范围。这支持“富集群体 + 连续倾向”的解释方式。

如果这是一个真实课题，后续报告里不能只写“Prog 细胞是髓系祖细胞”。更准确的表达应该是：Prog gate 中富集了一批 myeloid、erythroid/megakaryocytic 和 cycling 倾向更高的细胞；但也有过渡状态和 marker 不够明确的细胞，需要结合更多 marker、样本设计或功能实验来定位。

marker heatmap：把 score 落回具体基因

signature 是汇总指标，必须回到具体 marker。下面把代表性 marker 在无监督状态中的平均表达整理成 heatmap，并按连续性分数排序。

图 5. Hlf、Meis1、Procr、Mllt3 等支持 Stem/HSC 相关区域；Csf1r、Lyz2、Mpo、Elane、Irf8 支持 myeloid 倾向；Gata1、Klf1、Hba-a1/Hbb-bs、Pf4、Itga2b 支持 erythroid/megakaryocytic 倾向；Mki67、Top2a 等提示增殖活跃状态。这个图让“谱系倾向”回到基因证据上。

这类图要按成组证据来读。单个基因或局部高表达只能提供线索，只有 marker panel、signature score、metadata 和组成信息互相支持时，才适合写成细胞身份、状态或谱系倾向。

这一步也能防止文章变成“好看的 UMAP”。如果 heatmap 里没有成组 marker 支持，UMAP 上看起来再像分支，也只能作为形态线索。相反，当多个 marker 模块在不同状态中形成相互支持的趋势时，文章就可以更稳地讨论谱系倾向和过渡区。

监督谱系分数代理：用于排序，不代表轨迹

对于分化数据，最容易过度解释的地方是把 UMAP 分支写成命运树。本文构建了一个监督谱系分数代理：用下游谱系 signature 和 cell-cycle 信息与 Stem/HSC signature 做相对比较，得到 0-1 排序值。这个分数由预设 marker 定义，只用于排序和可视化。

图 6. 监督谱系分数代理在 UMAP 上呈连续分布，中间分箱中 HSPC、LT-HSC 和 Prog 发生混合。右图显示 Prog 的代理分数整体更高，但与 HSPC/LT-HSC 有重叠。该图说明预设 signature 与 FACS 富集关系相容，不证明轨迹方向。

这张图可以回答“预设 signature 与 FACS gate 如何对应”。UMAP 上存在标签混合，代理分箱中的 gate 组成逐步变化，同一 gate 内部也有分布范围。它支持非离散表达结构的描述，不能单独确定根节点、分支或发育方向。

marker 趋势：同一 marker 面板只作内部一致性检查

为了检查监督分数代理是否按定义工作，我们把代表性基因沿代理分箱求平均。由于这些基因与构建轴的 signature 有重叠，图 7 属于内部一致性检查。

图 7. Stem/HSC 相关基因在代理低端更明显，下游谱系和 cell-cycle 相关基因在高端或特定分箱增强。相同 marker 家族参与了代理构建，因此该图只说明计算结果内部一致，不能作为独立 trajectory 验证。

这类图要按成组证据来读。单个基因或局部高表达只能提供线索，只有 marker panel、signature score、metadata 和组成信息互相支持时，才适合写成细胞身份、状态或谱系倾向。

如果继续深挖，应加入未参与构建代理的 held-out marker，或使用明确根节点、稳定性评估和分支检验的 trajectory/pseudotime 模型。当前公开 counts 复现只保留“谱系相关表达梯度”和 FACS 富集边界。

连续 score 关系：保留重叠，不制造离散比例

没有外部独立标签时，把每个细胞强制分给最高 signature 会隐藏不确定性。两个分数接近、所有分数都低或只受细胞周期驱动的细胞，会被硬塞进某个类别。当前分析撤销这一步，只展示连续 score 之间的关系。

图 8. 左侧比较 Stem/HSC 与 Myeloid score，右侧比较 Ery/Meg 与 Lymphoid/Flt3 score，并用 FACS gate 着色。点云存在明显重叠和中间区域，因此不计算“某个 gate 中有多少细胞属于某谱系”。FACS gate 的富集方向仍可见，但它不提供单细胞终点身份。

这张图保留了原始问题：哪些细胞同时带有 stem 与下游程序，哪些细胞只有某一方向较高，哪些区域主要受 cell cycle 或测序深度影响。后续若要给离散身份，需要外部参考映射、作者独立标签或带拒绝规则的分类模型。

这类图很适合放进项目汇报。它能把“某个群体内部到底有什么”讲得比一张 UMAP 更清楚：不只告诉读者分成几群；告诉读者每个富集群体里哪些方向值得继续分支分析。

表达状态层面的组合证据

结尾处看无监督 state 的 FACS 组成和 signature profile。这个图把前面的 gate、state 和 signature 放到同一层级。

图 9. 不同表达状态中 FACS gate 组成不同，signature profile 也不同。某些 state 富集 Stem/HSC，某些 state 富集 Myeloid/Ery-Meg/Cell-cycle 倾向。它支持“状态 + 倾向 + 富集标签”的三层解释，而不能把 state 直接写成固定命运。

组成图必须和采样设计一起读。它能说明当前公开矩阵里哪些群体被观察到、样本或组织标签是否均衡，但不能直接外推成真实组织比例或临床差异。

对旧项目再分析来说，这种三层解释非常有用。原始项目可能只有粗略注释或 FACS 信息，但重新整理后可以把每个状态的 marker、signature、组成和连续位置串起来，为后续“该深挖哪一段”“哪些图可以放汇报”“哪些结论需要验证”提供依据。

复现边界图：哪些能说，哪些不能说

长文结尾处要把证据和边界放在一起看。Nestorowa 这类分化数据很容易被过度包装成“重建了完整命运路线”，但公开 counts 矩阵支持的是表达层面的倾向、富集关系和连续性线索。下面这张图把本文使用的数据层级、保留细胞数和可/不可解释的范围集中列出。

图 10. 本文可以支持 matrix-level QC、lineage-tendency gradients、FACS enrichment boundaries 和 marker-supported signatures；但不能仅凭公开 counts 矩阵给出作者内部 fate model 或单细胞命运验证。把这张边界图放在结论前，是为了避免读者把“表达倾向”误读成“确定命运”。

这张图把观察落到基因证据上。读的时候要看一组 marker 是否同向，而不是只挑某个显眼基因；如果证据只停留在 score 层面，结论也要保留探索性。

这里的重点是限制结论强度。公开矩阵能支持表达结构、marker 和 metadata 层面的复核；更强的机制、空间、功能或临床判断，需要 raw reads、原文模型、空间/病理信息或实验验证继续补证据。

与源论文主线的对照

本次复现与源论文主线一致的地方主要有三点。

第一，公开 HTSeq counts 矩阵仍然保留了 HSPC 分化相关的转录组结构。QC 后的 1,652 个细胞在 UMAP 和无监督 state 中形成清晰层次，FACS gate 与表达结构有对应关系。

第二，LT-HSC、HSPC 和 Prog 是 FACS 富集群体，不承担完全离散的终点身份。Stem/HSC、Myeloid、Ery/Meg、Lymphoid/Flt3 和 Cell-cycle signature 共同显示谱系相关表达差异，1,652 个细胞仍全部保持 unassigned。

第三，marker 层面的证据支持这种解释。Hlf/Meis1/Procr/Mllt3 等 stem marker，Csf1r/Lyz2/Mpo/Elane 等 myeloid marker，Gata1/Klf1/Hba/Hbb/Pf4/Itga2b 等 erythroid/megakaryocytic marker，以及 Mki67/Top2a 等增殖 marker，都能在不同状态中提供方向性证据。

需要保留的边界也很清楚。原文中的 fate model 和更完整的分化路线无法由本文这套公开复现完整重建。公开 counts 矩阵支持 FACS 富集边界、无监督状态和谱系相关表达梯度；某个单细胞的最终命运仍未被这套重分析单独证明。

深度解读：证据链和解释边界

回答范围：经典 HSPC 分化数据能否从公开 counts 矩阵中重新整理出可审查的 FACS 富集、无监督状态和谱系相关表达梯度。答案是可以，但 FACS gate、UMAP state 和最终命运必须分开解释。

raw / processed matrix 边界：GSE81682 公开的是 HTSeq counts 矩阵，适合做矩阵级 QC、表达标准化、marker/signature score 和低维可视化。它不等于从 FASTQ 重新比对的全流程再分析，也不包含所有实验层面的 fate validation。因此文章必须把“表达倾向”写成表达证据，而不等于机制或命运证明。

关键图读法：图 1 说明公开矩阵和 QC 边界；图 2 说明 FACS gate 和表达状态之间既有关联也有混合；图 3-5 用 signature 和 marker 证明不同谱系方向；图 6-7 展示非离散性和 marker 趋势；图 8-9 把群体组成、状态和 signature 合并到可汇报的层面。

不能过度解释的部分：不能把 UMAP 分支直接写成真实发育轨迹，不能把连续 signature 转成未经校准的最终命运，不能把 FACS gate 当成纯净细胞类型，也不能把监督谱系分数代理写成正式 pseudotime。本文展示的是公开矩阵层面的谱系相关表达梯度和富集边界。

继续深入的下一步：可以围绕关键过渡区做更细的 branch-specific marker 检查；可以引入正式 trajectory 方法，比较不同 pseudotime/lineage inference 的稳定性；可以把 cell-cycle 状态从 lineage 倾向中拆出来单独建模；也可以结合作者原始实验设计或额外数据，对特定谱系分支做更严格的验证。

对类似项目有什么启发？

HSPC 分化项目最容易出现两个相反问题：一种是把所有细胞硬分成几类，另一种是只说“连续变化”但拿不出具体证据。更需要保留的复现应该在两者之间建立证据链：先说明数据层级和 QC，再看 FACS 富集和 UMAP，接着用 marker/signature 解释倾向，结尾处用连续分箱和状态组成说明哪些结论能说、哪些只能作为后续方向。

这对公开数据复现和私有旧项目再分析都很实用。如果一个项目已经有 HSC/HSPC/progenitor 注释，但文章写不深，可以重新检查 marker 组合、富集边界、过渡细胞和 cell-cycle 干扰；如果已有 UMAP 但解释松散，可以把每个状态背后的 signature、组成和趋势整理成可复查的结果图。

• 痛点 2：分化连续性需要 UMAP、组成、marker 趋势和 signature 共同支撑。
• 痛点 3：单个 marker 不够稳，成组 marker 和 score 更适合解释谱系倾向。
• 痛点 4：公开 counts 复现能支持表达层面的倾向和边界，但不能替代实验命运验证。

小结

Nestorowa et al. GSE81682 的公开 counts 矩阵能恢复 HSPC 分化图谱中的主要表达结构：LT-HSC/HSPC/Prog 富集关系、Stem/HSC 与下游程序的连续 score、marker 层面的基因证据，以及非离散的表达连续性。当前没有给任何细胞分配新 lineage identity。

对于造血发育类单细胞项目，FACS 富集、表达状态、marker 证据、连续谱系程序和解释边界需要分开呈现。撤销最高分硬分类后，图中少了一组看似直观的比例，却保留了真实的不确定性，也给后续参考映射、轨迹模型和功能验证留下清楚入口。