复现 Puram et al. 头颈鳞癌单细胞图谱：从 GSE103322 到肿瘤微环境和 p-EMT 信号

科学更正（2026-07-19）： 初版 patient 解析只识别 HN 前缀，漏掉 HNSCC 与 HNSCC_，导致 5,058/5,902 个细胞被错误归为 unknown。现已统一解析为 HNSCC<number>：原论文纳入 18 位患者，当前公开列名可恢复 17 个患者 ID；另有 109 个 combo1/combo2 pooled 细胞，单列为 pooled source，不进入患者统计。17 位可恢复患者中，HNSCC8 和 HNSCC23 没有作者标注的 Cancer 细胞，因此 Cancer-cell patient signature 只覆盖其余 15 位。patient UMAP、patient composition 和相关表已重建。p-EMT 的患者/部位汇总现仅在作者标注的 Cancer 细胞内计算，非 Cancer 细胞只在 UMAP 中作为灰色背景。

Puram et al. 2017 年发表于 Cell 的头颈鳞癌单细胞数据，是肿瘤微环境和恶性细胞状态复现里非常适合做长文案例的一组公开数据。本文从 GEO processed matrix 出发，复现 5902 个细胞的 malignant / stromal / immune 图谱，并围绕 p-EMT、T cell exhaustion 和 hypoxia 相关信号做公开矩阵层面的复核。

为什么选这篇头颈鳞癌单细胞论文？

Puram et al. 的文章题目是 Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer。这篇文章的价值不只是一张肿瘤 UMAP；关键在于把头颈鳞癌样本中的恶性细胞、成纤维细胞、T 细胞、B 细胞、巨噬细胞、树突细胞、内皮细胞和其他低丰度群体放在同一个单细胞框架中解释。

对公开复现来说，它有三个很吸引人的点：

1. 数据来自真实原发和转移相关肿瘤样本，样本异质性明显。
2. GEO 提供了 processed expression matrix 和内嵌 metadata，适合从公开文件直接复现。
3. 原文中 p-EMT、CAF、T 细胞耗竭等概念很适合写成“图谱 + marker + signature + 边界”的长文。

这类文章最容易被写薄：只画一个 UMAP，然后说“复现了肿瘤微环境”。实际上，肿瘤单细胞复现必须处理更细的证据层级：恶性细胞和非恶性细胞的区分、样本来源对结构的影响、p-EMT 信号主要落在哪些细胞区域，以及 T 细胞耗竭 marker 是否集中在 T 细胞中。这些问题都需要逐图解释。

论文和数据来源

• 论文：Puram et al. Cell, 2017
• 论文题名：Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer
• PubMed：PMID 29198524
• 公开数据：GSE103322
• 公开矩阵：GSE103322_HNSCC_all_data.txt.gz

复现边界说明 GEO 页面提供的是 processed matrix，raw data not provided。因此本文复现的是公开表达矩阵层面的图谱、metadata 解析、marker 复核和 signature 解释，不声称从 FASTQ 重新比对或完整重做原文所有模型。

数据结构：metadata 和表达矩阵混在同一个 TXT 里

GSE103322_HNSCC_all_data.txt.gz 不是标准 10X 三件套，也不是现成 h5ad。文件第一行是细胞 ID；随后 5 行是逐细胞 metadata，包括 Maxima enzyme 处理标记、lymph node 标记、是否 classified as cancer cell、是否 classified as non-cancer cells，以及 non-cancer cell type；第 7 行开始才是基因表达矩阵。

这类格式非常适合提醒我们：旧单细胞数据复现的第一步不是跑 UMAP；读懂文件结构。如果直接把前几行 metadata 当成基因表达，或者把第一个基因行误当成 header，后面的分析会全部错位。本次复现先解析 metadata，再读取表达矩阵，并从细胞名中提取 patient 和 plate 信息。

• 公开矩阵细胞数：5,902
• 过滤后基因数：19,973
• 可识别患者标签：17（另有 109 个 pooled-combo 细胞）
• Leiden clusters：23
• 恶性细胞：2,215
• T 细胞：1,237

分析流程

• 下载 GEO processed expression matrix，并保存原始压缩文件。
• 解析前 5 行 metadata，整理 cancer/non-cancer、lymph node、non-cancer cell type、patient 和 plate 信息。
• 从第 7 行开始读取 gene × cell 表达矩阵，清洗基因名并转成 cell × gene 对象。
• 过滤低检出基因，进行高变基因选择、PCA、邻接图、UMAP 和 Leiden 聚类。
• 用公开注释整理 Cancer、Fibroblast、T cell、B cell、Macrophage、Endothelial 等主要群体。
• 用 marker dotplot 检查标签是否被经典 marker 支持。
• 计算 p-EMT、T cell exhaustion、hypoxia 等 signature score，并结合细胞群解释。

总体图谱：恶性细胞、基质和免疫群体分层

图 1 5902 个头颈鳞癌单细胞按公开注释整理的 UMAP。Cancer、Fibroblast 和 T cell 是最主要的三个群体，内皮、B cell、巨噬细胞、树突细胞、mast cell 等低丰度群体也能看到局部分布。

这个图的第一层信息是肿瘤微环境组成。Cancer 细胞和 T cell、Fibroblast 等非恶性群体在 UMAP 上形成相对不同的区域，说明公开矩阵保留了清楚的细胞类型结构。第二层信息是低丰度群体的边界：B cell、Macrophage、Dendritic cell、Mast cell、Myocyte 细胞数较少，适合做 marker 复核和组成展示，不适合在这篇文章中强行展开过深亚群。

患者来源：肿瘤样本异质性不能忽略

图 2 按 patient 标记 UMAP。不同患者在降维空间中的分布并不完全均匀，提示肿瘤样本来源是解释细胞组成和状态信号时必须保留的 metadata。

肿瘤单细胞数据和标准 PBMC 教学数据不同。PBMC 教学数据常常希望不同样本在主要细胞类型中混合较好；肿瘤数据则经常存在明显患者差异。某个患者可能恶性细胞更多，另一个患者可能成纤维细胞或 T 细胞更多。如果不看 patient-level 结构，就容易把患者组成差异误写成普遍的肿瘤生物学结论。

图 3 不同患者的细胞群组成比例。Cancer、Fibroblast 和 T cell 比例在患者间存在明显差异，这是后续解释 p-EMT、CAF 和免疫耗竭信号时必须考虑的背景。

组成图必须和采样设计一起读。它能说明当前公开矩阵里哪些群体被观察到、样本或组织标签是否均衡，但不能直接外推成真实组织比例或临床差异。

marker 复核：标签是否站得住？

图 4 主要细胞群 marker dotplot。Cancer 细胞中 EPCAM/KRT5/KRT14/TP63/KRT19 更突出；T cell 中 PTPRC/CD3D/CD3E/CD8A/CD4 更明显；B cell 中 CD79A/MS4A1 更突出；Fibroblast 中 COL1A1/COL1A2/DCN/VIM/MMP2 更高；Endothelial 中 PECAM1/VWF 提供支持。

这张 dotplot 是整篇复现的关键证据。公开 metadata 给了 cancer/non-cancer 和 non-cancer cell type，但复现不能只相信标签。恶性头颈鳞癌细胞应当有上皮/鳞癌相关 marker 支撑，成纤维细胞应当有基质和 ECM 相关 marker，T/B/髓系/内皮也应当能找到对应经典 marker。

这里有几个可解释点。Cancer 群体中 KRT5/KRT14/TP63/KRT19 信号较明显，符合鳞状上皮肿瘤细胞特征。Fibroblast 群体中 COL1A1/COL1A2/DCN/VIM/MMP2 更高，支持基质身份。T cell 中 CD3D/CD3E 和部分耗竭相关 marker 能看到信号，说明后续讨论 T cell exhaustion 有表达基础。低丰度 Dendritic cell、Macrophage 和 Mast cell 也有部分免疫 marker 支持，但因为细胞数较少，本文不展开过深功能结论。

p-EMT 程序：恶性细胞状态还是微环境信号？

图 5 p-EMT 相关程序评分，使用 TGFBI/VIM/MMP2/LAMC2/LAMB3/ITGA5/SERPINE1/PDPN 等基因构建。颜色只映射作者标注的 Cancer 细胞，非 Cancer 细胞为灰色背景。

Puram 原文中 p-EMT 是需要先确认的概念。部分 panel 基因也与基质、ECM、迁移和应激相关，因此全细胞评分会被 Fibroblast/Endothelial 等 compartment 混杂。本文只在 Cancer 细胞内做 patient/site 汇总；灰色非 Cancer 细胞只用于定位。

T 细胞耗竭和缺氧信号

图 6 T cell exhaustion 相关评分，使用 PDCD1/LAG3/HAVCR2/CTLA4/TIGIT/TOX 等基因构建。该图适合在 T cell 区域中解释耗竭相关表达线索。

这张图把观察落到基因证据上。读的时候要看一组 marker 是否同向，而不是只挑某个显眼基因；如果证据只停留在 score 层面，结论也要保留探索性。

图 7 Hypoxia 相关评分，使用 VEGFA/CA9/LDHA/ALDOA/ENO1/SLC2A1 等基因构建。该分数用于提示缺氧相关转录程序的空间分布。

T 细胞耗竭和缺氧都是肿瘤研究中容易被过度解释的概念。本文只做公开表达矩阵层面的 signature 复核，不把它扩展成治疗响应或临床结论。严谨的后续分析应该在 T cell 子集内细分 CD8、CD4、Treg、exhausted/cytotoxic 状态，并结合患者来源、样本部位和原文统计结果。

和源论文结论如何对照？

本文与原文一致的地方主要有三点。

第一，公开矩阵能够重建头颈鳞癌肿瘤生态系统的主要细胞成分。Cancer、Fibroblast、T cell 是最主要的群体，B cell、Macrophage、Dendritic cell、Mast cell 和 Endothelial 等群体也能被观察到。

第二，p-EMT 相关信号可以在作者标注的 Cancer 细胞内做表达层面的复核。本文没有完整重做原文 p-EMT 模型，也不使用全细胞 score 支持恶性细胞状态结论。

第三，患者来源差异明显，任何状态解释都不能脱离 patient-level composition。这与肿瘤单细胞研究的一般经验一致：样本差异是信号解释的一部分，不是可以忽略的背景噪音。

本文没有覆盖的部分也要明确：

1. 没有从 raw reads 重新比对和定量，因为 GEO 未提供 raw data。
2. 没有完整重做原文所有 malignant program、CNV 推断或统计模型。
3. 没有把 T cell、CAF、myeloid 群体继续细分到所有功能亚群。
4. 没有把 signature score 扩展成临床疗效或预后结论。

复现这类肿瘤数据时容易出错的地方

第一，metadata 行和表达行混在一起，必须先拆开。第二，肿瘤样本的患者来源很强，不能只看总体平均。第三，p-EMT、hypoxia、exhaustion 这类 signature 都不是某个单基因结论，需要结合细胞身份解释。第四，低丰度群体可以展示，但不要过度拆分。

主要结论 GSE103322 可以稳定复现头颈鳞癌主要肿瘤微环境结构，并支持 p-EMT、T 细胞耗竭和缺氧相关信号的公开矩阵层面复核。更有用的复现不只画 UMAP；关键在于把 metadata、患者组成、marker 证据、signature 来源和原文边界一起讲清楚。

这篇复现能作为哪些项目的模板？

• 肿瘤微环境复现：从公开矩阵整理 malignant、stromal、immune 主要组成。
• 旧 GEO 格式解析：处理 metadata 与表达矩阵混合在同一 TXT 的经典数据。
• p-EMT 信号复核：把原文主要 program 转成可视化 score，并说明解释边界。
• 患者组成检查：在样本层面展示细胞组成，避免把患者差异写成普遍规律。
• marker 证据链：用 DotPlot 检查公开注释是否被经典 marker 支持。
• 报告结果图整理：将 UMAP、组成图、marker 和 score 图整理成汇报可用图。

后续可以继续加深的方向

深度解读：这篇复现应该怎么读？

Puram 头颈鳞癌复现的重点，是把一个格式不标准但信息很丰富的 GEO TXT 文件，整理成可以严肃解读的肿瘤生态图谱。本文复核的是：metadata 行和表达矩阵能否正确拆分，Cancer/Fibroblast/T cell 等主要群体是否由 marker 支持，p-EMT、T cell exhaustion 和 hypoxia score 是否只能作为表达层面线索，以及患者来源如何限制结论。

1. 这篇复现回答了什么？

它回答的是“GSE103322 的 processed matrix 能否重建头颈鳞癌主要肿瘤微环境，并复核原文关注的 p-EMT 相关信号”。从本文结果看，5,902 个细胞中 Cancer、Fibroblast 和 T cell 是主体，Endothelial、B cell、Macrophage、Dendritic cell、Mast cell 和 Myocyte 等低丰度群体也能展示；EPCAM/KRT5/KRT14/TP63/KRT19、COL1A1/COL1A2/DCN/VIM/MMP2、CD3D/CD3E 等 marker 支持主要标签。

这篇复现也回答了一个实用问题：旧 GEO 文件不一定是标准 10X 格式，只要正确解析 metadata 和表达矩阵，仍然能整理出可复查的长文图谱。

2. raw / processed matrix 的边界在哪里？

GEO 页面明确 raw data not provided，因此本文不能从 FASTQ 重新比对，也不能完整重做原文所有 CNV、malignant program 或统计模型。GSE103322_HNSCC_all_data.txt.gz 是 processed matrix，而且前几行混有 metadata。本文能做的是公开表达矩阵层面的解析、降维、marker 复核和 signature score 展示。

这个边界对 p-EMT 尤其重要。本文可以检查 TGFBI/VIM/MMP2/LAMC2/LAMB3/ITGA5/SERPINE1/PDPN 等基因构成的表达 score 在图谱中的分布，但不能把这个 score 写成完整复刻原文 p-EMT 模型，更不能直接扩展为侵袭、转移或预后结论。

3. 主要图应该怎么读？

图 1 先看 Cancer、Fibroblast、T cell 和低丰度群体的总体结构；图 2 和图 3 必须看 patient-level 分布和组成，因为患者差异会明显影响后续解释；图 4 用 marker dotplot 复核公开注释；图 5 讨论 p-EMT score 时要同时看 Cancer 和 Fibroblast 区域；图 6 的 T cell exhaustion score 只适合在 T cell 语境中解释；图 7 的 hypoxia score 只能作为缺氧相关表达线索。

这篇文章不能按“一个 score 一段故事”的方式读。p-EMT、hypoxia、exhaustion 都是跨多个基因的表达概括，必须回到细胞类型、患者和样本部位背景中解释。

4. 哪些地方不能过度解释？

第一，不能把 p-EMT score 高分区域直接写成所有细胞都发生 partial EMT，因为其中一些基因与基质、ECM、迁移和应激也有关。第二，不能把 T cell exhaustion score 写成治疗响应或免疫逃逸机制。第三，不能忽略患者组成差异。第四，低丰度 Dendritic cell、Macrophage、Mast cell 和 Myocyte 可以展示，但不适合在本文中强行做深层功能亚群。

本文能严肃支持的是：GSE103322 能重建头颈鳞癌 Cancer/Fibroblast/T cell 主体结构，marker 证据支持主要标签，p-EMT、T cell exhaustion 和 hypoxia 相关 score 可以作为公开矩阵表达线索。本文不能支持的是：完整原文模型复刻、临床预后、治疗响应或未验证的机制因果。

5. 如果继续深入，下一步做什么？

继续深入时，第一步应在 Cancer 子集内分析 p-EMT、cell cycle、hypoxia 和 malignant program，避免 Fibroblast 表达影响恶性细胞解释。第二步在 T cell 子集内区分 cytotoxic、exhausted、Treg 和 memory-like 状态。第三步在 Fibroblast/CAF 子集内检查 ECM、炎症和 myofibroblast-like 程序。第四步按 patient、lymph node 标记和 primary/metastatic 背景分层，确认 signature 是否被少数患者驱动。

对头颈鳞癌这类肿瘤复现来说，严肃写法不是把 p-EMT、hypoxia、exhaustion 全部堆成机制结论；逐个说明它们在什么细胞群中可见、受哪些患者组成影响、当前矩阵能支持到哪一层。

小结

这次复现从 GSE103322 processed matrix 出发，整理 5902 个头颈鳞癌单细胞，复核了 Cancer、Fibroblast、T cell、Endothelial、B cell、Macrophage、Dendritic cell 等主要群体。基于公开矩阵可以观察 p-EMT、T cell exhaustion 和 hypoxia 相关信号，但这些结果必须放回细胞类型和患者组成中解释。