复现 Lee 结直肠癌单细胞数据：四个组成变化站住了，边界也必须一起写

单细胞研究里，细胞很多并不自动等于统计证据很强。决定结论强度的是另外几件事：这些细胞来自多少位患者、正常与肿瘤是否配对、组成分析的分母是什么，以及某个细胞类型在部分样本中完全缺失时，伪计数是否替代了真实丰度。

这次复现从一个看似简单的问题出发：在 Lee 等人的结直肠癌单细胞数据中，肿瘤与邻近正常之间，哪些广义细胞区室的变化能够在患者级配对设计中重复出来？进一步地，状态比例、pseudobulk 表达差异和患者程序关联，能否提供相互独立的证据？

结论不是“所有层面都发现显著差异”。站得住的主结果集中在组成层：上皮细胞与髓系细胞的回收份额增加，B 细胞与基质细胞的回收份额下降；T 细胞的原始百分比虽然上升，但相对于其余可估计部分的几何中心，其 CLR 变化接近零且不显著。状态层与患者关联层没有形成同等强度的发现。pseudobulk 层出现大量差异行，却集中在 T cells 与 Stromal 两个区室，而且跨区室同向背景非常广，不能把每个单基因结果直接解释成区室特异机制。

本文的重点不在多报几个 P 值。要写清楚的是三件事：哪些部分可以进入几何中心，结论的主语是什么，以及零发现究竟属于生物学阴性还是统计分辨率限制。

论文和数据来源

公开数据中的比利时队列位于另一 accession，不在本次矩阵闭包内；原论文的空间与配体—受体分析不在本文讨论范围。

一、先把 91,103 个细胞的算术闭合

本次分析使用公开表达矩阵与样本注释，最终纳入 91,103 个细胞、33 个样本。主推断回到患者与样本层，没有把 91,103 个细胞当成 91,103 个独立重复。用于肿瘤—正常配对组成检验的是 10 位同时具备两侧样本的患者，也就是 20 个配对范围内样本；其余样本用于总体结构、标签审计和分母说明，不被偷偷加入配对检验。

这一步看似只是计数，其实决定了整篇文章的统计单位。细胞是测量单位，患者才是生物学重复。若直接在细胞层做组间检验，同一患者内数千个高度相关的细胞会被误当作独立证据，P 值可以极小，却不能代表十位患者之间的一致性。

另一个必须说明的边界是 accession。公开数据中的比利时队列位于另一 accession，不在本次矩阵闭包内。因此本文复现的是当前公开矩阵覆盖的队列，不把未纳入的数据描述成“已经验证”。

二、两侧 QC 不对称时，比例是回收结果

图 01 展示了从原始矩阵到配对分析的分母链。不同样本的细胞回收量并不相等，肿瘤侧和正常侧的 QC 后细胞构成也不完全对称。单细胞比例的主语因此必须是“在本次消化、捕获、过滤和标签流程后回收到的细胞份额”，不能直接升级为组织中的真实细胞密度。

例如，肿瘤组织更难消化，某些基质细胞更容易丢失；上皮肿瘤细胞可能在样本制备或质量控制中获得不同的存活概率。即使患者级配对差异高度一致，也只能说明回收份额的变化与疾病状态稳定相关。若要声称组织组成，需要组织学计数、空间成像、流式绝对计数或其他独立测量支持。

本文所有“增加”“下降”都遵守这个限定。后文的百分比点变化用于帮助读者理解量级，CLR 用于组成学推断；二者都不等于每克组织的细胞数量。

三、全矩阵嵌入能展示结构，不能替代患者级检验

全矩阵嵌入显示了上皮、T、B、髓系、基质和肥大细胞等广义区室。图中不同区室在低维空间中形成可读结构，也能看到样本与疾病状态带来的混合和偏移。

但嵌入图的作用是描述：它告诉我们细胞表达结构如何排列、标签是否出现明显冲突、某些区室是否可能被批次或样本主导。它不能回答“十位患者中是否一致”，也不能把数万个点当作统计重复。本文不会依据 UMAP 上的距离宣称细胞迁移、谱系转换或疾病轨迹。

标签来自当前矩阵上的 marker 结构与已有注释信息。这里必须区分两个概念：标签在当前表达矩阵中自洽，不等于标签已经被外部实验独立验证。

四、标签自洽不是外部验证

图 03 将每个广义标签的 marker 表达与门槛逐项展开。上皮、T、B、髓系和基质等区室在定义 marker 上总体具有预期方向，说明这些标签不是随机贴上的名称。

不过，这仍属于内部自洽审计。用于定义或支持标签的基因，又被拿来证明标签正确，不能算独立验证。更强的验证应当来自与定义 marker 不重叠的基因集合、蛋白层、空间位置、分选标签或人工复核。

因此本文在表述上使用“marker 自洽”“标签结构可读”，不使用“准确率”“被验证的细胞身份”等更强说法。图中的门槛用于暴露不确定性，而不是隐藏它。

五、无监督结构对标签说了什么

图 10 从另一方向检查标签：先看无监督聚类结构，再问每个簇被哪些广义标签占据、簇内纯度如何、是否存在一个簇被多个互不相容的标签平均瓜分。

结果支持广义区室在表达结构上的可分性，但也显示广义标签内部仍包含大量状态与患者差异。一个“髓系”标签并不等于一个均一细胞群；T cells、Stromal 等区室同样包含多种状态。正因如此，后续状态分析必须在母区室内部进行，而不是用全体细胞作为分母制造谱系差异。

这张图的作用是给后文划定边界，不在于再做一次漂亮的聚类：广义组成变化可以在患者级检验；更细状态必须服从母区室细胞数与患者覆盖门槛。

六、组成分析之前，先决定哪些部分可估计

组成数据有一个基本约束：所有部分之和固定。某一部分上升，会机械地挤压其他部分的比例。CLR 将每个部分写成它相对于所有纳入部分几何中心的对数比，因此“哪些部分进入几何中心”会影响每个结果。

本次门禁在配对范围内的 20 个样本上执行。上皮、T、B、髓系和基质细胞在每个样本中都有实际观测，因此进入推断。肥大细胞在 20 个配对样本中有 8 个低于每样本 1 个细胞的硬零门槛，且全部 33 个样本中有 21 个为零，因此被排除。

门槛为每个样本至少 1 个细胞，类型明确标记为 hard_zero。它的含义仅限于最低限度地避免一个部分在多个样本中完全由伪计数定义，并不表示“检测下限已经充分控制”。表中同时公布最差样本的细胞数、单细胞对应的百分点和伪计数位移，读者可以判断门槛是否足够保守。

在五个可估计部分上进行 10 对患者的精确配对符号翻转检验。10 对设计共有 2^10=1,024 种符号分配；双侧极端值及其全体取反各出现一次，所以最小可达 P 为 2/1,024=0.001953125。

结果如下：

• 上皮细胞：平均百分比点变化 +16.21，平均 ΔCLR +1.052，P=0.0078125，BH q=0.009765625；
• 髓系细胞：+16.15 个百分点，ΔCLR +1.875，P=0.001953125，q=0.006510417；
• B 细胞：−23.40 个百分点，ΔCLR −1.684，P=0.00390625，q=0.006510417；
• 基质细胞：−12.42 个百分点，ΔCLR −1.169，P=0.00390625，q=0.006510417；
• T cells：+4.43 个百分点，但 ΔCLR −0.074，P=0.767578125，q=0.767578125。

四个结果通过全家族 BH 校正。T cells 的例子尤其重要：原始回收份额上升，不代表它相对于其余可估计部分的几何中心也上升。它的主语必须是“相对于当前组成参照系”，不能简化成“肿瘤中 T 细胞减少”。

七、结论经得起哪几种拆法

图 09 同时展示等细胞下采样、门槛变化、留一部分参照与门槛事件。敏感性分析要改变的是可能影响结论的环节，而非把同一个结果换几种颜色再画一次。

门槛阶梯覆盖 1、5、20 个细胞，触及后续 pseudobulk 所使用的 20 细胞门槛；每一档都重新决定可估计集合并重算效应、P 与 q，而不是只列出“谁还在”。若门槛使几何结构塌缩到两个部分，表中明确标记退化两部分几何，不把它伪装成与主分析等价的稳健性证据。

下采样用于检查结果是否主要由细胞回收量更高的样本驱动。留一部分分析用于检查某个组成部分是否通过几何中心把其余所有部分整体推移。四个主结果在多种拆法中保持方向与主要量级，支持它们不是单一分母选择的产物。

“稳健”仍不等于“组织真值”。这些敏感性只在同一公开矩阵内部改变分析选择，不能消除组织消化、捕获偏好和未做空间验证的限制。

八、为什么肥大细胞必须排除

肥大细胞只有 187 个，在 21/33 个样本中为零，在配对范围内 8/20 个样本低于硬零门槛。若把它放进 CLR 几何中心，伪计数会在大量样本中替代真实丰度。

独立审计显示，把肥大细胞错误纳入后，它本身达到最小可达 P=0.001953125，并给其余每个部分施加约 +0.5012 的共同位移。T cells 的 ΔCLR 会从 −0.074 变成约 +0.427，方向解释随之改变。这个变化的来源是几何中心被一个稀疏部分拉动，与新的生物学无关。

这也是本文最可复用的方法学结论：组成分析不能在检验结束后，再根据 P 值决定哪些部分“看起来可用”。可估计集合必须在看结果之前冻结，并在运行时同时校验 estimable、excluded、门槛、样本范围和 gate 类型。只比对 estimable 不够，因为重新标注可能让 excluded 集合改变而不触发警报。

九、状态检验必须在母区室内部

细胞状态比例的分母是对应母区室，不是全体细胞。例如 T 细胞状态的比例应在 T cells 内计算，髓系状态应在 Myeloids 内计算。否则，广义区室本身的组成变化会被错误地包装成状态变化。

本次状态检验设置每个患者—侧别至少 20 个母区室细胞，并要求足够的配对患者。图 05 展示通过门槛的状态及其患者级变化。没有通过门槛的状态不会被填成零，也不会用细胞层 P 值补位。

状态层结果整体弱于广义组成层。它们适合描述哪些方向值得继续验证，但不能被写成与四个组成发现同等强度的主结论。状态标签仍来自当前表达矩阵，缺乏蛋白、空间或功能层的独立确认。

十、二十三位肿瘤患者的异质性

图 06 将肿瘤侧患者放在同一尺度上比较。不同患者的上皮、免疫与基质回收份额差异很大，说明“平均肿瘤”只是统计摘要，不代表任一具体患者。

异质性并不会否定配对结果。配对设计利用同一患者的正常侧作为参照，减少患者间基线差异；但它提醒我们，平均 ΔCLR 不能用来给单个患者作判断，也不能直接推导治疗反应或预后。

图中 23 位肿瘤患者用于展示肿瘤队列结构；组成主检验仍只使用十位有配对正常侧的患者。展示人数与推断人数必须分开写，不能借更大的展示队列暗示更大的统计样本量。

十一、pseudobulk：发现集中在两个区室

表达差异按患者、侧别和广义区室聚合为 pseudobulk，再做配对检验。这样每个患者在一个区室内贡献一个表达向量，避免把同一患者的成百上千个细胞当作独立重复。

结果表中有 7,427 行通过 BH，但这些发现集中在 T cells 与 Stromal 两个区室。其他三个区室的零发现不能简单解释为“没有表达变化”：离散配对检验的最小 P 与测试基因数共同限制了可达 q。若一个区室只有少量有效配对患者，即使基因达到最小 P，经过成千上万个基因的 BH 校正也未必能越过 0.05。零发现必须与这种分辨率天花板一起出现。

更关键的是跨区室背景块。效应一致性审计识别出 1,114 个跨区室共享基因，其中 889 个方向一致。这里未做 ambient RNA 校正。来自高丰度上皮或其他区室的游离转录本、统一的应激反应、样本处理差异，都可能在多个区室中留下同向信号。

因此任何单基因“区室特异”叙述之前，都必须先说明这个背景块。本文不会因为某基因在某个区室 q<0.05，就直接把它写成该区室独有的肿瘤机制。更可信的候选应同时满足：区室内效应稳定、跨患者方向一致、不是广泛共享背景的一部分，并有独立实验或外部队列支持。

十二、六项患者关联均未通过校正

图 08 检查六项患者级程序—状态关联。结果为 0/6 通过 BH。这个结果需要如实写成“在当前样本量与当前定义下没有形成经过多重校正的患者级关联”，不能写成“已经证明不存在关联”。

关联分析的有效样本量远小于细胞数。每位患者只有一个肿瘤侧程序汇总值，某些状态还受母区室 20 细胞门槛约束。缺失值不会被填零，有效 n 会进一步缩小。相关系数的方向可以作为探索线索，但不能绕过 q 值成为结论。

同样，横断面相关不建立因果与时间顺序。一个髓系程序与某状态同向，不代表前者诱导后者，也不构成细胞间通讯的证据。

十三、结论、限制与可复用做法

本次复现最终保留四个患者级配对组成结果：上皮与髓系回收份额相对增加，B 与基质回收份额相对下降。T cells 的原始百分比上升，但相对于其余可估计部分的 CLR 变化接近零，不能简化成一个无参照的“增多”或“减少”。

这些结论的边界同样重要：

1. 比例描述的是回收细胞份额，不是组织绝对组成；
2. 可估计集合在检验前冻结，肥大细胞因大量硬零而排除；
3. 广义标签是 marker 自洽，不是外部独立验证；
4. 状态检验在母区室内部进行，并受 20 细胞与配对覆盖门槛约束；
5. pseudobulk 发现集中在两个区室，其他区室零发现受离散 P 与 BH 分辨率限制；
6. 1,114 基因的跨区室共享背景、其中 889 个同向，加上未做 ambient 校正，限制了单基因区室特异解释；
7. 六项患者级关联没有通过多重校正；
8. 横断面数据不能建立治疗、预后、轨迹或细胞通讯因果。

最可复用的做法是一条分析顺序，而非某个 marker：先固定统计单位，再做分类零审计；先冻结组成学可估计集合，再计算 CLR；每次敏感性分析都重算效应与 P/q；零发现同时报告可达下限和 BH 天花板；任何区室特异表达叙述之前，先检查跨区室同向背景。

在单细胞复现中，能留下四个受边界约束的患者级结果，比从九万个细胞里列出几十个未经审计的“发现”更有价值。

复算说明：为什么四个 q 值不是细胞数堆出来的

组成检验的输入是每位配对患者在肿瘤侧与正常侧的 CLR 差，每个细胞并不单独占一行。以髓系细胞为例，先在每个样本内计算髓系相对于五个可估计部分几何中心的对数比，再对同一患者做肿瘤减正常。十位患者得到十个差值；检验只改变这十个差值的正负号，不改变任何细胞标签，也不把同一患者内的细胞重新当作独立样本。

十个差值共有 1,024 种符号组合。若观测均值是所有组合中最极端的一个，那么把十个符号全部取反会得到大小相同、方向相反的另一个极端值。因此双侧 P 的最小值是 2/1,024，而不是 1/1,024。髓系结果正好达到这个下限，表示十位患者的配对变化方向与量级形成了枚举中最极端的模式之一；它不表示“真实效应概率为 99.8%”，也不提供临床预测准确率。

五个部分构成同一个组成学检验家族，原始 P 一起进入 Benjamini–Hochberg 校正。排序后，髓系、B 和基质的 P 分别位于最低几档，因此共享 q=0.006510417；上皮的 P=0.0078125，对应 q=0.009765625。T cells 的 P 接近 0.77，不会因其他部分显著而自动获得支持。这里没有按每个部分各自“校正”，也没有在看见结果后把肥大细胞从家族中删除；家族与可估计集合都在推断前确定。

百分比与 CLR 为什么可以方向不同

百分比回答“该部分占所有回收细胞的多少”，CLR 回答“该部分相对于纳入几何中心的其余组成如何变化”。设一个样本的五部分计数为 x1 到 x5，加入预先声明的伪计数后，某部分的 CLR 等于 log(xi) 减去五个 log 计数的平均值。所有 CLR 在一个样本内之和为零，所以它天然带有参照。

若上皮与髓系同时大幅增加，它们会抬高几何中心。T cells 即使百分比增加，只要增加幅度小于几何中心的整体上移，CLR 仍可略微下降。本文 T cells 的 +4.43 个百分点与 −0.074 ΔCLR 正是这种情况。两者没有谁“算错”；它们回答的是不同问题。

因此文章不能只保留更符合直觉的百分比，也不能只展示 CLR 而不告诉读者原始份额。图 04 将两种量并置，正文使用“回收份额”作为百分比的主语，并给 CLR 加上“相对于当前可估计部分几何中心”的限定。任何脱离参照的“T cells 减少”或“T cells 增加”都会丢失一半事实。

为什么伪计数不能成为隐形参数

单细胞组成表经常出现零。直接取 log(0) 不存在，因此分析通常加入伪计数。问题不在于能否使用伪计数，而在于伪计数是否替代了大量样本中的真实观测。

若某部分在一个样本有 500 个细胞，0.5 个伪计数对 log 值影响很小；若真实计数为零，整个 log 值都由 0.5 决定。肥大细胞在大量样本中为零，因此它的 CLR 主要反映“选择了什么伪计数”，而不是“观测到了多少肥大细胞”。把这种部分放入几何中心，还会同时移动其他所有部分。

本次可估计性表不仅给出是否纳入，还给出最差样本计数、最差样本总细胞数、单个细胞对应的百分点和伪计数造成的 log 位移。这样读者可以判断：门槛为 1 个细胞只是硬零保护，不是完善的检测下限模型。门槛阶梯进一步把 1、5、20 个细胞下的可估计集合与重算结果全部公开，避免把一个任意阈值包装成自然常数。

留一患者、下采样与留一部分各在问什么

三类敏感性不能互相替代。留一患者检查某个结果是否由单一患者驱动：每次删掉一位患者，重新计算平均配对 ΔCLR，观察方向与范围。若删掉某人后方向反转，主结果就不能被称为患者间一致。

等细胞下采样检查高回收量样本是否获得了更大影响。主检验虽然在患者层进行，但样本内组成估计的精度仍随细胞数变化。让每个样本贡献相同数量细胞，再重复抽样，可以观察结果是否依赖某几个深测样本的精细比例。

留一部分分析检查几何中心依赖。每次从 CLR 参照中去掉一个部分，其他部分的中心都会改变。如果一个结论只在某个特定部分存在于分母时成立，它更像参照选择的产物。三种敏感性分别针对患者杠杆、回收深度和组成参照，全部稳定才构成比“换一个随机种子仍显著”更强的稳健性证据。

pseudobulk 的 7,427 行应该怎样读

“7,427 行通过 BH”听起来像七千多个独立生物学发现，实际不是。一个基因可以在多个区室出现，一组共变基因可以共同反映同一个样本处理过程，基因间也高度相关。行数是统计表规模，不是机制数量。

本文先按患者、侧别、区室聚合原始计数，再在有足够配对覆盖的区室内检验。这样避免细胞伪重复，却不会自动消除 ambient RNA、组织消化应激或患者级批次。跨区室效应一致性审计因此不再要求每个区室都先显著，而是问一个基因是否在至少三个区室方向一致、且其他区室效应没有相差到不合理程度。这个标准比“在多个区室都 q<0.05”更适合发现共享背景，因为不同区室的有效配对数和表达量不同，显著性本来就不可直接比较。

识别出的 1,114 基因背景块中有 889 个同向。这不证明它们全部是污染；共同炎症反应、缺氧、应激和真实系统性改变都可能贡献。但在没有 ambient 校正与独立空间证据时，它足以否定一种过强写法：不能从单一区室的一行显著结果，直接断言该基因由该区室特异诱导并驱动肿瘤过程。

三个区室零发现为何可能是分辨率问题

精确检验的 P 不是连续任意小的。有效配对患者越少，最小可达 P 越大。pseudobulk 每个区室还要同时校正数千个基因；即使某基因达到该区室的最小 P，BH q 也可能仍高于 0.05。

因此“0 个基因通过 BH”至少有三种解释：效应确实很小；噪声很大、功效不足；或者离散 P 与检验数共同形成了不可越过的 q 天花板。当前三个零发现区室属于后两类边界不能排除的情况。本文把每个区室的有效配对数、P 下限和达到 q<0.05 所需的极端基因数量一起报告，拒绝把统计上无法分辨写成生物学上不存在。

相反，T cells 与 Stromal 的大量结果也不自动更可信。它们需要经过跨区室背景、效应方向、表达覆盖与外部证据的进一步筛选。阳性与阴性都要受到同一套分辨率审计。

患者程序关联为什么没有“挑一个最接近显著”的结果

六项关联属于一个预先定义的家族，0/6 通过 BH。若只选最小 P 的一项写成“趋势”，再把其余五项藏在补充表里，就会把多重尝试的成本转嫁给读者。

本文保留全部六项及 q 值，并把“无经过校正的关联”作为结果本身。相关系数仍可用于生成后续假设，但后续验证必须在新的患者队列中预先指定方向与程序定义。不能在同一批 23 位肿瘤患者中挑选程序、挑选状态、挑选相关方向，再把最有利的组合当作独立验证。

此外，程序和状态都由同一表达矩阵派生，测量误差与样本质量可能共同影响两端。即使相关通过校正，也仍是同源数据中的患者级相关，不是细胞通讯、因果路径或治疗靶点证明。

怎样复用这套流程

对于新的单细胞组成项目，可以把流程压缩为八个可执行问题：

1. 生物学重复是患者、样本还是动物，是否被细胞数偷偷替代？
2. 所有条件是否具有相同的组织、分选与测序覆盖？
3. 每个候选部分在推断范围内有多少硬零，最差样本只有几个细胞？
4. 可估计集合是否在查看效应与 P 之前冻结？
5. CLR 的参照集合、伪计数和门槛是否写入产物并在运行时复核？
6. 敏感性分析是否重算了效应、P 与 q，而非只输出成员列表？
7. 零发现是否同时报告最小可达 P、检验家族与 q 天花板？
8. 区室特异表达是否先通过跨区室同向背景与 ambient 边界审计？

这些问题不会让数据自动产生更多阳性结果，却能让留下的结果更接近它实际支持的强度。本文的四个组成变化之所以可写，靠的是统计单位、组成参照、可估计集合、敏感性与解释主语形成的一条闭合证据链，与它们是否拥有最小的 P 无关。

读结果表时，先看哪几列

面对一张组成统计表，最容易先看 P 和 q。更稳妥的顺序应当相反。第一步看 n_pairs，确认结论究竟由多少位患者支持；第二步看 minimum_attainable_two_sided_p，判断检验在该样本量下能分辨到什么程度；第三步看效应及留一患者范围，确认方向是否被单一患者控制；第四步看可估计性表，确认该部分是否在每个推断样本中都有实际观测；P 与 q 放在这四步之后再看。

以髓系结果为例，十对患者、ΔCLR +1.875、留一患者后范围仍为正、P 达到设计下限、五部分家族内 q=0.0065。这几列共同支持“配对肿瘤侧的髓系回收份额相对于其余可估计部分增加”。若只剩 P=0.00195，而留一患者方向反转或大量样本为零，结论强度会完全不同。

T cells 则展示另一种读法。它有十对患者，原始百分比点为正，但 ΔCLR 接近零，留一患者范围跨零，P 与 q 均很大。可以写的结论是当前组成参照下没有稳定的相对变化，而“T cells 没变化”是过度的读法；百分比与 CLR 的方向差异本身需要保留。

对 pseudobulk 表，顺序还应增加两步：先看区室有效配对数和该区室的 BH 分辨率，再看基因是否位于跨区室共享背景块。一个 q 很小但在多个区室同向的基因，可能是重要的系统性信号，也可能是 ambient 或样本处理背景；在没有外部证据前，它不能被冠以区室特异机制。

本文能够推出什么

在当前公开矩阵和十位配对患者中，可以推出四点：

• 上皮与髓系回收份额相对于五部分组成参照稳定增加；
• B 与基质回收份额相对于同一参照稳定下降；
• 这些方向不依赖肥大细胞伪计数、单一患者、单一回收深度或单一 CLR 参照部分；
• 表达层存在集中于 T cells 与 Stromal 的患者级差异，同时存在广泛跨区室同向背景，需要进一步筛选。

“可以推出”不等于“已在所有队列重复”。这里的复现是对当前 accession 内公开矩阵的独立重算；比利时队列、空间层、蛋白层和绝对组织计数不在本次闭包内。

本文不能推出什么

本文不能证明肿瘤组织中每平方毫米的上皮或髓系绝对数量增加，因为没有组织绝对计数；不能证明 B 与基质细胞真实死亡或迁出，因为回收效率可能改变；不能把 T cells 的百分比变化直接写成浸润增强或衰竭；不能从横断面程序关联建立分化轨迹；不能把共享表达背景中的单个基因写成某区室特异的驱动因子；也不能从 23 位肿瘤患者的展示图推出预后或治疗反应。

这些“不能”属于结果定义的一部分，不是文章的附属免责声明。科学结论的完整形式应当同时包含对象、统计单位、对比、效应量、参照和证据边界。例如：“在十位配对患者、五个预先冻结的可估计部分构成的 CLR 参照下，肿瘤侧髓系回收份额相对增加，ΔCLR +1.875，精确符号翻转 P=0.001953，五部分 BH q=0.00651。”删掉其中任何一项，读者都可能把相对回收结果误读成组织绝对事实。

为什么阴性层也值得发布

状态层与六项患者关联没有提供与组成层同等强度的阳性结果，但它们防止文章被写成一条过度完整的机制链。若只展示组成变化，再挑几个表达基因和相关系数，读者很容易补完成“组成变化—状态激活—患者程序关联”的连续故事。实际证据并没有闭合这条链：状态层受母区室门槛限制，关联层 0/6 通过校正，跨区室背景又限制单基因解释。

把阴性层与功效、分辨率一起发布，可以区分“查过但没有形成证据”和“根本没有查”。前者会约束后续叙述，后者只是空白。复现文章的价值不仅是确认哪些结果保留，也包括阻止哪些故事从同一矩阵中被不当延伸。

最终证据清单

交付树中的每张图都绑定源表与 SHA256；组成决策、共享统计模块、smoke、脚本和设计冻结文件均进入 provenance。除运行时和峰值内存外，所有登记产物在隔离重跑中逐字节一致。运行时被明确列为故意不登记，因为墙钟时间和内存本来就不能字节复现。

这种工程闭包不替代科学审查，却能回答一个基本问题：文章中的数字究竟来自哪张表、哪段代码和哪组输入，后来改动是否改变了结果。对涉及多个门槛、敏感性和图件的深度复现，如果没有这条闭包，即使正文写得谨慎，也很难证明最终发布的图与评审时检查的是同一棵结果树。

这三个结果最容易被怎样误读

第一种是把”回收份额”缩写成”组织含量”。标题、图注和任何简写版本都必须保留回收限定，不能因为篇幅短就删掉结论主语。第二种是把 T cells 的百分比上升与 CLR 轻微下降二选一；两者必须并列，否则任何单方向说法都会失真。第三种是把 7,427 行 pseudobulk 结果读成七千多个区室特异发现；跨区室 1,114 基因背景块和未做 ambient 校正这两件事，必须出现在任何单基因举例之前。

篇幅越短，边界越容易掉。一个只讲得下四句话的版本，应当保留的是四个组成结果、肥大细胞的硬零门禁、T cells 的参照矛盾和跨区室背景这四项，而不是四个 q 值。压缩可以改变篇幅，不能改变证据等级。

复现边界

这次复现能支持的，是十位配对患者、五个预先冻结的可估计部分构成的 CLR 参照下的四个组成学结果，以及它们在留一患者、门槛阶梯、等细胞下采样和留一部分参照下的稳定性。不能支持的是组织内绝对细胞数量、任何单基因的区室特异机制、六项患者程序关联中的任何一项，以及治疗、预后、轨迹与细胞通讯方向的因果。三个 pseudobulk 零发现区室受离散 P 与 BH 天花板限制，不等于该区室没有表达变化。这些边界与四个结果同属结果本身，不是附加声明。