复现 Kang et al. 的 IFN-beta PBMC 单细胞数据：从公开 GEO 到免疫响应图谱

这是一篇围绕 Kang et al. 经典 PBMC IFN-beta 刺激数据的长文复现记录。目标不只放一张 UMAP；本文从公开 GEO 数据、样本设计、质控后细胞规模、无监督结构、细胞注释、IFN marker、response score 和原文边界对照几个层面，把一组可复用的单细胞复现案例讲完整。

注释与统计单位修订（2026-07-19）： 当前 H5AD 只保留 CellTypist 最终 broad label，没有 posterior、top-two margin 或 unassigned 字段，因此本文中的标签与精确比例只作描述和 marker 复核。进一步对齐作者 batch2 metadata 后，28,871 个 QC 细胞中有 28,559 个成功匹配，按作者 singlet 标记保留 24,250 个；individual 级主分析改用作者 paper_celltype。22,622 个 singlet 在作者标签与 broad label 之间一致，占 93.3%。Megakaryocytes 的一致率仅 9.9%，不进入稳定的跨注释结论。本文的 cell-level score 和组成差值仍属探索性展示，8 个 original individual 的配对结果见同一数据的 individual 级分析文章。

为什么选这组数据？

Kang et al. 的 GSE96583 是单细胞 RNA-seq 里非常适合做复现展示的经典案例。它的优点很明确：实验问题清楚，公开数据可下载，PBMC 细胞类型相对熟悉，IFN-beta 刺激带来的转录响应也有一组非常经典的 marker 可以交叉验证。

这类数据适合回答三个层次的问题：

1. 技术层面：公开 GEO 数据能不能重新整理成可分析的单细胞对象？
2. 细胞层面：control 和 IFN-beta stimulated 两组 PBMC 是否覆盖相近的主要免疫细胞类型？
3. 生物学层面：IFN-beta 刺激是否在不同免疫细胞类型中诱导出一致但强弱不同的 interferon response？

这三个问题连起来，才构成一个比较完整的复现故事。如果只展示“刺激组 marker 变高”，容易忽略样本平衡、细胞组成和注释可靠性；如果只展示“细胞类型注释”，又很难说明这组数据的免疫响应价值。

论文和数据来源

这篇复现对应的原始研究是 Kang 等发表于 Nature Biotechnology 的文章。原文题目是 Multiplexed droplet single-cell RNA-sequencing using natural genetic variation，关键方法学重点是利用自然遗传变异进行混池样本拆分，并在 PBMC IFN-beta 刺激数据中展示单细胞层面的免疫响应分析。

• 论文：Kang HM et al. Nature Biotechnology, 2018
• DOI：10.1038/nbt.4042
• Journal：Nature Biotechnology
• PubMed：PMID 29227470
• 公开数据：NCBI GEO GSE96583

GEO 页面中包含多个样本。本次复现选择 batch 2 的两个公开样本作为主体：GSM2560248 batch 2 control 和 GSM2560249 batch 2 stim。它们分别对应 6 小时未刺激 PBMC 和 6 小时 IFN-beta 刺激 PBMC。

**复现边界说明：**原文的重点包括多样本混池、遗传变异辅助拆分和 donor-level 分析。本篇文章不声称完整复现整篇方法学论文；重点聚焦公开 batch 2 control vs IFN-beta stimulated PBMC 数据，复现其中最适合展示的单细胞免疫响应图谱。

数据规模和样本平衡

质控后的对象包含 28,871 个细胞和 15,586 个基因。control 组有 14,526 个细胞，占 50.31%；IFN-beta stimulated 组有 14,345 个细胞，占 49.69%。两组细胞数量非常接近，这对后续比较需要先确认。

• QC 后细胞：28,871
• QC 后基因：15,586
• Leiden clusters：14
• control 细胞，50.31%：14,526
• IFN-beta 细胞，49.69%：14,345

图 1 按实验条件标记的 UMAP。两组细胞数量接近，并且都覆盖 PBMC 的主要区域。这个结果说明后续比较不是建立在明显失衡的一组细胞上。

从图 1 可以看到，control 和 IFN-beta stimulated 两组不是各自占据完全不同的 UMAP 区域。对于刺激实验来说，这是合理的：IFN-beta 主要改变转录状态，而不是把 PBMC 变成另一种细胞类型。也就是说，条件标签应该在已有免疫细胞群上呈现“状态差异”，而不是把 UMAP 完全切成两半。

图 2 按 GEO 样本标记的 UMAP。这里主要用于确认两个输入样本在降维空间中的覆盖情况，避免把样本来源差异误读为细胞类型差异。

这张图回答的是来源和比例问题。它适合用来发现样本不平衡、分组偏移或需要子集分析的地方；更强的生物学解释还要结合原文设计和额外证据。

分析流程：从 matrix 到可解释图谱

本次复现采用标准单细胞 RNA-seq 分析流程。重点不是堆参数；保证每一步都能服务后面的解释。

• 从 GEO 下载并整理 matrix、barcodes、genes，构建可读取的 10X 格式输入。
• 按细胞 UMI、检测基因数、线粒体比例等指标进行质量控制，去除明显低质量细胞。
• 合并 control 与 IFN-beta stimulated 两个样本，并保留样本和条件 metadata。
• 执行归一化、高变基因选择、PCA、邻近图构建、Leiden 聚类和 UMAP。
• 用免疫细胞参考模型生成 PBMC broad label，并用 marker 与原文 metadata 交叉检查；当前对象不含置信度或 unassigned 处理记录。
• 检查 IFN response marker 的表达分布，并计算每个细胞的 IFN response score。
• 按条件和细胞类型汇总响应强度，区分“细胞组成变化”和“细胞内表达状态变化”。

图 3 Leiden 无监督聚类结果。先看无监督结构，再进入细胞类型注释，可以减少直接依赖注释标签带来的误判。

Leiden 聚类给出 14 个 cluster。这个结果不是最终生物学结论，但它提供了一个中间检查点：如果 UMAP 上没有清晰结构，或者 cluster 和样本条件高度绑定，后续注释与 marker 解释都要非常谨慎。这里的结构更接近 PBMC 的主要细胞群分布，适合进入下一步注释。

PBMC 主要细胞类型结构

参考注释显示，数据中可见 T cell、myeloid、innate lymphoid cell、B cell 和 dendritic cell 等主要 PBMC 群体。由于当前对象缺少注释置信度和拒绝规则，下面的细胞数用于描述当前对象，不作为确定身份比例。作者标签对齐和敏感性结果在深度复现中单独展开。

图 4 PBMC 细胞类型结构。T cell、myeloid、B cell、innate lymphoid cell 和 dendritic cell 等主要群体在 UMAP 上形成相对清晰的区域。

更细的 cell-state 标签同样缺少 posterior 和 unassigned 记录，只用于定位 marker 与响应区域。它们不能替代作者 metadata，也不用于样本层面的身份比例推断。

图 5 更细的细胞状态注释。粗粒度细胞类型适合做总体组成比较，细粒度状态更适合定位 monocyte/macrophage/DC 等髓系相关响应。

组成图必须和采样设计一起读。它能说明当前公开矩阵里哪些群体被观察到、样本或组织标签是否均衡，但不能直接外推成真实组织比例或临床差异。

细胞组成：不要把组成差异误当成表达响应

在刺激实验里，一个常见误区是看到某个 marker 在刺激组更高，就直接解释为所有细胞都发生了相同变化。单细胞数据需要先看组成，再看表达。否则，如果某个响应很强的细胞类型在刺激组比例更高，总体表达差异就可能被组成差异放大。

图 6 两组样本的细胞类型组成对比。这个视角用于判断刺激响应是否可能受到细胞组成差异影响。

这个表说明当前 broad-label 对象中的主要群体比例接近。它只能帮助排查明显组成偏移。IFN response 是否在同一类细胞内部上升，还需要回到作者 cell type 和 original individual 层面的配对汇总；深度复现已完成这一步。

IFN-beta 刺激后的关键 marker

本次复现重点检查了经典 IFN response marker：

ISG15, IFIT1, IFIT2, IFIT3, MX1, MX2, OAS1, OAS2, OAS3, STAT1, IRF7, IFI6, IFI27, RSAD2

这些基因覆盖了 interferon-stimulated genes、抗病毒相关通路和 JAK-STAT 下游转录响应。对于 IFN-beta 刺激 PBMC 来说，这组 marker 不只是“好看的基因”；关键是判断复现是否抓住关键生物学信号的关键检查点。

图 7 IFN response marker 在 UMAP 上的表达分布。多个经典 ISG 在刺激条件相关区域被明显点亮，说明数据中保留了清晰的 IFN-beta 响应信号。

marker 和 score 要成组解释。单个基因高表达只能提供线索；只有 dotplot、heatmap、signature、metadata 和组成结果互相支持，才适合写成细胞身份或状态判断。

从单基因 UMAP 可以看空间分布，但它不适合判断一组 marker 的整体模式。因此还需要 DotPlot，把每个 marker 在不同分组中的表达强度和表达比例放在一起看。

图 8 按条件比较 IFN marker。刺激组在 ISG15、IFIT、MX、OAS、STAT1、IRF7 等基因上呈现整体上调。

这张图把观察落到基因证据上。读的时候要看一组 marker 是否同向，而不是只挑某个显眼基因；如果证据只停留在 score 层面，结论也要保留探索性。

图 9 按细胞类型查看 IFN marker。这个视角用于判断响应是否集中在某些免疫细胞群，还是广泛存在于多个主要群体。

这里最重要的不是某一个 marker；它是一组 marker 的方向是否一致。IFN-beta 刺激后，ISG15、IFIT1/2/3、MX1/2、OAS1/2/3、STAT1、IRF7 等基因整体增强，这与 IFN-I 反应的经典生物学预期一致。

IFN response score：把一组 marker 压缩成可比较指标

为了减少单基因噪音，本次复现基于 14 个 IFN response marker 计算每个细胞的 IFN response score。这个分数不是新的实验发现；关键在于把 marker 组表达压缩成一个便于比较的指标，适合回答两个问题：

1. IFN-beta stimulated 组整体是否高于 control？
2. 哪些细胞类型的上移幅度更明显？

图 10 按条件比较 IFN response score。刺激组整体分布明显上移，说明 IFN-beta 诱导信号不是单个 marker 的偶然现象。

这张图把观察落到基因证据上。读的时候要看一组 marker 是否同向，而不是只挑某个显眼基因；如果证据只停留在 score 层面，结论也要保留探索性。

图 11 按细胞类型比较 IFN response score。Myeloid、dendritic cell、T cell 和 B cell 中都可见刺激组上移。箱线图的统计单位是细胞，不能据此比较人群层面的响应强弱。

这个表里需要单独看 myeloid 和 dendritic cell。它们的 cell-level IFN response score 差值分别约为 2.35 和 2.31，高于 T cell 的 1.48。该差值描述两个 pooled GEO 矩阵中的细胞分布，不能当作 individual-level 效应比较。

不过，granulocyte 在这里虽然差值较高，但该群体细胞比例低且两组组成差异明显，因此更适合当作提示性结果，而不是文章主结论。一个负责任的复现报告，应该同时说明强信号和不适合过度解释的地方。

**结果边界：**当前 cell-level 图显示 IFN-beta 刺激后多个 PBMC 区域的 marker 和 score 同向上移。细胞类型间强弱差异仍需按 original individual 复核。深度分析使用作者标签后，CD4 T、CD8 T、NK、B、CD14+/FCGR3A+ monocyte 和 dendritic cell 的配对方向保持一致；Megakaryocytes 因注释一致率和细胞数不足而降级。

和源论文/经典教程结果如何对照？

原始 Kang et al. 论文的主线是多样本混池单细胞测序和 demuxlet 方法，利用自然遗传变异把混在一起测序的细胞分配回不同个体，并进一步研究 IFN-beta 刺激下的细胞类型特异响应和遗传调控差异。本文没有复现 donor genotype 拆分和遗传变异部分；复现公开数据中最直接、最适合展示的 batch 2 control vs IFN-beta PBMC 响应图谱。

与源论文和常见教学案例相比，本次复现的一致点包括：

1. 实验对照是一组 control PBMC 和一组 IFN-beta stimulated PBMC。
2. 主要观察对象是 PBMC 中不同免疫细胞群的刺激响应。
3. IFN response marker 包括 ISG15、IFIT、MX、OAS、STAT1、IRF7 等经典基因。
4. 结论不是“PBMC 整体有响应”这么粗；强调细胞类型层面的响应差异。

差异和限制也需要明确：

1. 本文使用 batch 2 的两个 GEO 样本进行复现，没有覆盖原文全部 donor 和全部混池拆分分析。
2. 细胞类型注释使用现代参考模型辅助完成，和原文当时的注释流程不完全相同。
3. 本文还没有展开 donor-level differential expression、eQTL 或 genetic interaction 分析。
4. 当前重点是公开数据整理、主要图谱复现和免疫响应解释，不把它包装成完整方法学论文复刻。

这个边界需要先确认。可用的复现文章应该说明“复现了哪一部分”，也说明“没有复现哪一部分”。这样读者才能判断结果是否能支持自己的课题需求。

这类复现里有用的检查点

如果把这组数据当作一个可复用模板，最有价值的不是某一张图；重点是下面这些检查点：

• 样本是否平衡：control 与 stimulated 细胞数接近，减少了后续比较的明显偏倚。
• 结构是否合理：Leiden 和 UMAP 先给出无监督结构，再做注释，避免直接相信标签。
• 组成是否稳定：T cell 和 myeloid 等主要群体比例接近，支持细胞内响应解释。
• marker 是否成组一致：IFN marker 需要整体上调，而不是挑一个好看的基因。
• 响应是否可量化：response score 把多基因模式变成可比较指标。
• 限制是否说清楚：低丰度群体、注释差异和未复现模块都需要明确标注。

这些检查点也适用于其他公开 GEO / SRA 单细胞数据复现。尤其是老文章、经典数据集或已有 h5ad / Seurat 对象，经常需要重新整理 metadata、统一结果图风格、补充中文解释，并把结果转成可以放进汇报、基金申请或文章补充材料的图。

可以继续加深的分析方向

如果要把这个案例继续做深，后续可以补充几类结果：

本篇先完成的是“公开数据到免疫响应图谱”的主体复现。对于很多实际课题来说，这一步已经能回答一个关键问题：公开数据里是否存在清晰、可解释、可继续展开的单细胞信号。

深度解读：这篇复现应该怎么读？

Kang IFN-beta PBMC 这篇文章是当前站点的长文标尺。它的重点不是免疫细胞能不能聚成团；它能不能在同一套公开数据里同时看清楚细胞类型结构和刺激响应：control 与 IFN-beta stimulated 两组是否都保留主要 PBMC 群体，IFN marker 是否成组上调，response score 是否把这种响应量化出来，以及哪些解释不能越过公开数据边界。

1. 这篇复现回答了什么？

它回答的是“公开 GSE96583 batch 2 PBMC 数据能否重建 IFN-beta 刺激后的单细胞免疫响应图谱”。本文整理得到 28,871 个质控后细胞，覆盖 T cell、myeloid、B cell、innate lymphoid cell 和 dendritic cell 等主要 PBMC 群体；同时，IFN marker 和 IFN response score 显示刺激组出现清楚上移，myeloid / dendritic cell 相关群体响应更强。

这类结论需要把实验设计、细胞身份和处理组响应连在一起。读者可以检查每一步是否互相支持：细胞组成是否大致稳定，marker 是否支持当前标签，IFN score 是否在 stimulated 组整体上升，以及 original individual 层面的配对方向是否一致。

2. raw / processed matrix 的边界在哪里？

这篇数据可以支持 PBMC 主要细胞类型和 IFN response 层面的复现，但不能被写成完整重做源论文所有模型。公开矩阵能告诉我们每个细胞的表达模式、条件标签和主要免疫结构；它不能替代原始建库过程、全部 donor 层面扩展、所有批次控制细节，也不能自动给出每个细胞状态的最终功能定义。

因此本文把复现目标限定在“公开数据到免疫响应图谱”：QC 后细胞规模、UMAP 结构、细胞类型 marker、condition 分层、IFN marker 和 response score。更深的 donor-specific response、细胞类型内差异表达、基因调控模型和统计检验，需要在明确样本层级和批次设计后继续做。

3. 关键图应该怎么读？

读这篇文章要按“结构先于响应”的顺序。先看总体 UMAP 和细胞注释，确认 T cell、myeloid、B cell、innate lymphoid cell、dendritic cell 等群体没有明显错位；再看组成图，确认 control 和 stimulated 之间不是单纯由某个大细胞群比例变化驱动；然后看 IFN marker 和 response score，判断刺激效应是否在多个基因上共同出现。

如果跳过细胞组成和 marker 检查，直接看 IFN score，很容易把细胞类型差异误读成刺激响应。比如 myeloid / dendritic cell 本身就更容易带有抗病毒和炎症相关表达，如果不在细胞类型内部继续比较，就不能把所有高分都写成同一种处理效应。

4. 哪些地方不能过度解释？

第一，不能把 IFN response score 写成功能实验。它是多基因表达分数，用来概括刺激组的转录响应。第二，不能把所有细胞类型的响应强弱直接写成治疗效果或疾病机制。第三，不能忽略 donor、批次、刺激时间和细胞类型组成对差异表达的影响。第四，低丰度 dendritic cell 或 innate lymphoid cell 的结论要比 T cell / myeloid 主体更谨慎。

本文能严肃支持的是：GSE96583 中 IFN-beta stimulated 组存在清晰的 interferon-stimulated gene 表达上移，而且这种响应能在主要 PBMC 群体中观察到不同强度。本文不应该写成“证明某个疾病治疗机制”，也不应该把每个 cluster 都解释成稳定免疫亚型。

5. 如果继续深入，下一步做什么？

继续深入时，最值得做的是细胞类型内 stimulated vs control 差异表达，而不是在所有细胞混在一起时直接比较。T cell、B cell、myeloid、DC 应分别建模，必要时加入 donor 或批次因素，避免把组成差异当成响应差异。随后可以把 IFN-I response、antigen presentation、inflammatory response 等 gene set 做成更系统的 score，并和源论文关键图逐项对照。

这篇数据对真实项目的启发也很直接：凡是处理刺激、感染、药物处理或免疫干预单细胞数据，都应该先把细胞身份和处理响应拆开。先证明“谁在响应”，再讨论“响应说明什么”。这个顺序比单纯增加 cluster 数更重要。

小结

这次复现从 GSE96583 的 batch 2 control 与 IFN-beta stimulated PBMC 出发，得到 28,871 个质控后细胞，覆盖 T cell、myeloid、B cell、innate lymphoid cell、dendritic cell 等主要 PBMC 群体。IFN marker 和 IFN response score 均显示刺激组出现清晰上移，且 myeloid / dendritic cell 相关群体响应更强。

这里还需要说明的是，这个案例展示了单细胞复现不应该停在“跑出 UMAP”。一份有用的复现记录，需要同时交代数据来源、样本设计、质控规模、细胞组成、marker 证据、定量指标、与源论文的关系，以及不能过度解释的边界。