复现 Deng et al. 小鼠早期胚胎单细胞数据：从 GSE45719 到阶段连续性和等位基因边界

Deng et al. 的 GSE45719 是早期单细胞 RNA-seq 文献中的经典数据。原文聚焦 dynamic random monoallelic gene expression，公开补充文件则同时保留 RPKM、reads、CAST_hits 和 C57_hits。本文先限定可复现层级：使用 gene-level expression.txt.gz 重建 zygote 到 late blastocyst 的阶段表达结构，并把等位基因机制留在 raw-read、SNP-aware 分析范围内。

统计单位修订（2026-07-19）： 文件名可以恢复部分 embryo ID。268 个主分析细胞中，260 个可归入 36 个 stage + embryo_id 单位：4-cell、8-cell、16-cell 和 early/mid/late blastocyst 分别恢复 4、7、4、3、3、2 个 embryo ID，early/mid/late 2-cell 分别恢复 3、5、5 个。4 个 zygote 及 early/mid 2-cell 各 2 个 0r 样本没有可恢复 embryo ID。图 4-7 在可恢复阶段先按胚胎聚合 score 或表达；无 ID 细胞以红色 X 单独保留为描述性点。样本量较小且部分阶段缺 ID，本文不做阶段显著性检验。

为什么这篇适合做专题级复现？

Deng et al. 2014 年 Science 文章最被记住的部分，是用 CAST/Ei 和 C57BL/6 杂交背景在单细胞层面研究等位基因表达。这个主题本身很有吸引力，但也很容易在公开复现时写过头：看到补充文件里有 CAST_hits 和 C57_hits，就直接把原文的 random monoallelic expression 结论照搬过来。这样做并不严谨。

本次复现的痛点正是这个边界。GEO 提供的 expression.txt.gz 文件包含每个样本的 gene symbol、RefSeq ID、RPKM、reads、CAST_hits 和 C57_hits。它们足以重建 stage expression matrix，足以看 zygote、2-cell、4-cell、8-cell、16-cell、blastocyst 的表达结构，也足以审计母源、ZGA、pluripotency、TE-like、primitive-endoderm-like marker 趋势。但如果要重新得出 allele-specific mechanism，需要 raw reads、SNP-aware alignment、杂交方向和基因层面的等位基因判定规则，这不等于简单合并 RPKM 表能完成的。

所以这篇文章不等于“避开原文关键”，要把复现问题拆清楚：公开表达矩阵能支持什么，原文 raw-level 机制需要什么，类似发育项目应该怎样在不夸大的前提下挖出可用图和可写结论。

论文和数据来源

论文、数据和公开矩阵信息如下。这里先把来源和矩阵层级交代清楚。

公开矩阵进入分析前，先确认数据层级和规模。

复现边界： 本文使用 GEO 补充文件中的 per-sample expression.txt.gz，以 RPKM 和 reads 字段构建 expression-level matrix。CAST_hits 和 C57_hits 只用于说明公开文件中存在等位基因计数字段，不用于重建 random monoallelic expression 或 X-inactivation 机制。后者需要 raw-read / SNP-aware pipeline。

样本筛选：先把胚胎主线和技术/对照样本分开

GSE45719 的补充包里共有 317 个表达文件，不等于全部都应该进入早期胚胎阶段轴。文件名中可以解析出 16-cell、8-cell、4-cell、early/mid/late 2-cell、early/mid/late blastocyst、zygote，也可以看到 adult liver RNA、fibroblast、C57 two-cell control、pooled/split 技术样本。

这一步如果不做，后续 UMAP 会把不同样本来源、技术拆分和非胚胎对照混在一起，文章看起来“细胞更多”，但发育解释反而不干净。主分析只保留 zygote、early/mid/late 2-cell、4-cell、8-cell、16-cell、early/mid/late blastocyst 的 268 个胚胎单细胞；adult liver、fibroblast、C57 two-cell control 和 pooled/split 技术样本只作为数据边界说明。

图 1. 主分析保留 268 个胚胎单细胞，阶段覆盖 zygote、2-cell、4-cell、8-cell、16-cell 和 blastocyst。右侧显示没有进入主图的文件类型：非胚胎对照、C57 two-cell control 和技术 split/pooled 文件。这个步骤直接决定后续结论是否干净。

组成图必须和采样设计一起读。它能说明当前公开矩阵里哪些群体被观察到、样本或组织标签是否均衡，但不能直接外推成真实组织比例或临床差异。

组成和交叉表需要回到采样、分选和处理流程里解释。它能说明当前公开矩阵中哪些群体被观察到、哪些标签互相吻合，但不能直接外推成组织真实比例、临床差异或完整空间生态。

方法流程：用 expression matrix 复现阶段结构，而不等于重建 raw-level 机制

本文的处理顺序从数据层级开始：下载 GSE45719 补充包和 series metadata，核对 PubMed、DOI、GEO accession 和文件类型；解析每个 expression.txt.gz，按 gene symbol 合并重复记录，保留 RPKM、reads、CAST_hits、C57_hits 四类字段；从文件名提取 stage、样本类型和可恢复的 embryo ID，剔除 non-embryo control、strain control 与 technical split/pooled 文件；构建 gene × cell RPKM 矩阵，计算 detected genes、total reads 和等位基因 hit 总量；使用 log1p(RPKM)、表达过滤、高变基因、PCA 和 UMAP 重建阶段结构；marker、signature score 与代表基因在可恢复阶段先按胚胎求均值，再做阶段级描述。

这个流程的关键不等于追求复杂；保持结论和输入数据匹配。对于类似旧项目，如果手上只有 processed matrix，先把阶段轴、marker 和边界做扎实，通常比直接套用原文全部机制更负责任。

PCA/UMAP：阶段标签能否形成可解释结构？

主分析矩阵过滤后保留 15,202 个基因，用高变基因进行 PCA 和 UMAP。可以看到早期 2-cell、4-cell/8-cell、16-cell 以及 blastocyst 阶段在表达空间中有明显结构。

图 2. PCA 和 UMAP 都显示 stage-associated transcriptome structure。PCA 更适合读整体发育轴，UMAP 更适合看不同阶段在非线性空间中的分离。这里支持“表达矩阵保留了阶段结构”，但不能把 UMAP 距离解释为真实发育时间、细胞迁移或个体命运路径。

低维结构只回答表达空间是否可读。颜色或区域分开说明标签、阶段或状态和表达矩阵存在对应关系；它还不能单独证明谱系方向、空间位置、机制强弱或最终命运。

这张图解决了第一层问题：公开 expression table 不只能做文件统计，它可以复现胚胎发育阶段相关的整体表达结构。对于客户项目或旧数据重分析，这一步相当于判断“数据还有没有可整理成图的主轴”。

发育连续性：用 PC axis 和 stage centroid 看趋势

如果只看 UMAP，容易把发育状态理解成几个离散小岛。发育数据更应该结合 PC axis、stage centroid 和 marker trend 一起读。本次复现中 PC1 对 stage 有明显响应，各 stage 在 PCA 空间中的中位点也能连出大致的 zygote-to-blastocyst 路径。

图 3. 左图显示 PC1 随发育阶段变化，中图把各 stage 的 PCA centroid 连起来，右图显示 detected genes 与 CAST/C57 hit summary 的关系。右图的目的不等于做 allele-specific 结论；提示公开文件确实含有等位基因 hit summary；机制重建仍需要 raw-level pipeline。

这张图把观察落到基因证据上。读的时候要看一组 marker 是否同向，而不是只挑某个显眼基因；如果证据只停留在 score 层面，结论也要保留探索性。

这个图很适合回答“发育连续性体现在哪里”：不等于一句“连续发育”；有表达轴、有 stage centroid、有后续 marker trend 支撑。

marker heatmap：stage identity 是否由 marker 支持？

阶段结构不能只靠降维。我们整理了 maternal/oocyte、ZGA/2-cell、pluripotency/ICM、trophectoderm 和 primitive endoderm 相关 marker，检查它们在 stage mean expression 中的相对变化。

图 4. 可恢复 embryo ID 的阶段先计算每个胚胎的 marker 均值，再对胚胎均值汇总；zygote 因无 embryo ID，仅保留细胞均值作为描述。Zscan4 家族和 Dux 在 2-cell 附近达到高值，Pou5f1、Sox2、Nanog、Cdx2、Krt8、Gata6、Pdgfra 等呈现后续阶段变化。

这类图要按成组证据来读。单个基因或局部高表达只能提供线索，只有 marker panel、signature score、metadata 和组成信息互相支持时，才适合写成细胞身份、状态或谱系倾向。

这一步也是文章可信度的关键。如果只有 UMAP，没有 marker panel，读者很难判断阶段轴到底是生物学结构还是技术差异。marker heatmap 把阶段标签和已知发育基因联系起来，能支撑更具体的解释。

signature score：用基因集减少单基因不稳定性

单细胞表达矩阵中，单个基因容易受表达稀疏和检测不稳定影响。为了避免只围绕一个 marker 写结论，我们计算了 maternal/oocyte、zygotic activation、pluripotency/ICM、trophectoderm、primitive endoderm 和 cell-cycle 等 signature score。

图 5. 箱线图和黑点使用 embryo-mean score；红色 X 表示没有可恢复 embryo ID 的 zygote 或 0r 细胞。maternal/oocyte、ZGA/2-cell、pluripotency/ICM、trophectoderm 和 primitive-endoderm score 沿 stage 呈现不同方向。它们用于趋势审计，不承担 fate classifier 或机制证明。

这类图要按成组证据来读。单个基因或局部高表达只能提供线索，只有 marker panel、signature score、metadata 和组成信息互相支持时，才适合写成细胞身份、状态或谱系倾向。

这类 score 在项目报告里很有用：它能把多个基因的信息压缩成可读图形，同时提醒读者不要把单基因波动写成过强结论。

代表基因趋势：哪些变化可以直接展示？

下一步把代表基因逐一画成趋势线。相比 heatmap，趋势图更适合讲“阶段变化不等于硬切标签；表达状态逐步改变”。

图 6. 普通点表示每个可恢复 embryo ID 的平均表达，连线连接各阶段 embryo mean 的中位数；红色 X 表示无 embryo ID 细胞。Zscan4c/Zscan4d 在 2-cell 附近达到高值，Pou5f1、Sox2、Nanog、Cdx2、Gata6、Krt8、Pdgfra 在后续阶段呈现不同趋势。图中不使用细胞级 bootstrap，也不做阶段显著性推断。

这里要先看数据本身是否站得住。公开矩阵能保留多少 metadata、检测深度是否均衡、样本分组是否清楚，决定了后续结论能写到哪一层。

从阅读习惯看，这张图应该紧跟 marker heatmap 和 signature score，而不能把五六张图连续堆在一起。读者先看到总体阶段结构，再看到 marker，再看到每个基因的趋势，解释链才顺。

blastocyst lineage-like score：能做线索，不能做命运判定

在 blastocyst 阶段，我们进一步看 trophectoderm 和 primitive-endoderm-like score。它们能帮助理解 blastocyst 内部表达差异，但仍然是 expression-program clue。

图 7. 前两幅图保留 blastocyst 细胞在 UMAP 上的连续 score，第三幅图改为 embryo-mean TE-like 与 primitive-endoderm-like score。该图用于查看表达程序分布，不能替代 lineage tracing 或胚胎内独立身份验证。

这类图要按成组证据来读。单个基因或局部高表达只能提供线索，只有 marker panel、signature score、metadata 和组成信息互相支持时，才适合写成细胞身份、状态或谱系倾向。

这说明发育文章最容易过度解释的地方：marker score 能支持“某类表达程序更强”，但并不等于“这个细胞命运已经确定”。

CAST/C57 字段：为什么不能直接重写等位基因机制？

GSE45719 的每个 expression 文件中确实有 CAST_hits 和 C57_hits。这让它不同于普通 RPKM 表，也解释了为什么原文能围绕 monoallelic expression 展开。但公开复现时，看到这两列并不等于完成等位基因分析。

图 8. CAST 和 C57 hit totals 在公开文件中可见，但这些 totals 只是样本层级和基因层级 hit summary 的一部分。本次没有从 FASTQ 重新比对到 strain-aware reference，没有重新调用 SNP，没有重建 gene-level monoallelic 判定规则，因此不能把 random monoallelic expression 或 X-inactivation dynamics 当成本次复现结论。

组成图必须和采样设计一起读。它能说明当前公开矩阵里哪些群体被观察到、样本或组织标签是否均衡，但不能直接外推成真实组织比例或临床差异。

这个边界需要在文章中明确写出来。否则读者会误以为“有 CAST/C57 列”就等于“已完成 allele-aware reproduction”。科研 blog 的严肃性也体现在这里：越吸引人的机制，越要说明证据层级。

source-paper comparison：哪些与原文主线一致，哪些只是边界对照？

与原文相比，本次复现能支持三个表达层面的结果。第一，GSE45719 的公开文件确实保留了从 zygote 到 late blastocyst 的阶段表达结构。第二，2-cell 附近的 Zscan4/Dux/Tcstv 等相关 marker 和后续 blastocyst lineage-like marker 有清楚趋势。第三，公开文件中存在 CAST/C57 hit summary，说明原文的等位基因问题有数据基础。

但本次复现没有把这些 hit summary 进一步升级为机制结论。原文的 random monoallelic expression 和 paternal X chromosome inactivation spread 需要更强的 raw-read/SNP-aware 证据链。我们可以在文章中解释它们为什么是原文关键，也可以说明为什么本次 processed expression 复现不能直接重写这些结论。

图 9. GEO 文件层级、主分析矩阵规模和结论审计概览。对类似公开数据复现来说，先把数据层级分清楚，比直接追求“复现原文所有结论”更可靠。

这张图先用于核对输入层级。细胞数、基因检测量、样本标签和矩阵层级如果没有对齐，后面的降维、marker 和组成分析都只能算可视化，不能作为复现结论。

这里的重点是限制结论强度。公开矩阵能支持表达结构、marker 和 metadata 层面的复核；更强的机制、空间、功能或临床判断，需要 raw reads、原文模型、空间/病理信息或实验验证继续补证据。

深度解读：证据链和解释边界

• raw / processed matrix 边界：RPKM 表能支持 expression-level stage map；random monoallelic expression 和 X-inactivation dynamics 需要 raw-read、SNP-aware alignment 和 allele-calling 规则。
• 关键图读法：PCA/UMAP 读整体阶段结构；PC axis 和 centroid 读连续性；marker heatmap 和 trend line 读基因证据；CAST/C57 图只读数据层级，不读机制。
• 不能过度解释的部分：不能把 UMAP 距离写成真实时间；不能把 score 写成命运判定；不能把 CAST/C57 totals 写成完整 allele-specific mechanism。
• 继续深入的下一步：应回到 SRA/FASTQ 或原始比对层，建立 strain-aware reference，重新做 SNP-aware counting、基因层面等位基因判定和 X 染色体相关分析。

图 10. 结论审计：本次支持 stage expression structure、marker trends 和 lineage-like expression clues；探索性结果包括 score 差异和 PC/UMAP 连续性；不支持 raw-read remapping 后的 random monoallelic expression、X-inactivation dynamics、胚胎活性或个体命运判定。

这张图把观察落到基因证据上。读的时候要看一组 marker 是否同向，而不是只挑某个显眼基因；如果证据只停留在 score 层面，结论也要保留探索性。

这里的重点是限制结论强度。公开矩阵能支持表达结构、marker 和 metadata 层面的复核；更强的机制、空间、功能或临床判断，需要 raw reads、原文模型、空间/病理信息或实验验证继续补证据。

对类似项目有什么启发？

这篇数据很适合提醒我们：经典论文复现不能把原文摘要改写一遍，也不能把全部结论原样搬到公开矩阵上。更需要保留的工作，是把输入层级、可复现图形、marker 证据和解释边界对齐。

如果一个旧的单细胞项目只剩 processed matrix，仍然可以做很多有用工作：重建阶段或细胞类型结构，整理 marker panel，做 signature score，检查是否存在连续发育轴，找出可用于汇报或文章补图的结果。但如果项目问题已经进入 allele-specific、isoform、variant、spatial niche、功能机制或临床质量层面，就必须回到更强的数据层或实验设计。

小结

Deng et al. GSE45719 的公开表达文件可以复现小鼠早期胚胎阶段结构：268 个主分析细胞形成 zygote 到 blastocyst 的表达轴，其中 260 个细胞可归入 36 个 stage + embryo_id 单位。Zscan4/Dux/Tcstv、Pou5f1/Sox2/Nanog、Cdx2/Krt8/Gata6/Pdgfra 等 marker 和胚胎级 signature 汇总共同支持阶段与 lineage-like program 的描述。

random monoallelic expression 和 X 染色体失活动态仍属于原文的 raw-level 机制主线，当前 processed RPKM 分析没有重建这部分。明确区分表达阶段复现与等位基因机制复现，能避免把补充文件中的 hit summary 误写成完整 allele-aware 结论。